Генетическое исследование

Генетическое исследование на мутацию гена LHX3 в настоящее время предлагает Университет Утрехта и несколько других лабораторий. В случае обнаружения мутации у животного с карликовостью необходимость в дальнейших эндокринологических исследованиях (включая измерение ГР) отпадает.

Все немецкие овчарки карликового размера, исследованные в Университете Утрехта за последние 3 года (т. е. после того, как тест стал доступен), имели мутацию в LHX3 (H.S. Kooistra, личная переписка, 2013). Для теста необходимо 2 мл плазмы с ЭДТА, взятой в любое время. Гипофизарная карликовость у других пород, кроме немецкой овчарки (и родственных пород) и у кошек крайне редка. Это означает, что большинство случаев заболевания можно диагностировать генетическим методом. В очень малом числе случаев, когда результат генетического исследования отрицателен или исследование невозможно (например, у кошек), можно измерить концентрацию ГР после стимуляции РГГР, клонидином или ксилазином. К сожалению, измерение концентрации ГР предлагают очень немногие лаборатории (например, Утрехтского Университета). Если измерить концентрацию ГР возможно, сначала ветеринарному врачу следует исключить различные эндокринные и неэндокринные причины задержки роста (см. рамку 2-3). У непропорциональных карликов в первую очередь следует исследовать функцию щитовидной железы (см. главу 3). В последующем вместо ГР можно измерять концентрацию ИФР-1. При этом возможны ложноположительные результаты (т. е. низкая концентрация ИФР-1 по другим причинам) и, следовательно, результат необходимо интерпретировать с осторожностью (см. «Гормональные исследования»).

Базальная концентрация гормона роста

Как и при многих других эндокринных нарушениях, измерение базальной концентрации гормона в циркулирующей крови почти не имеет диагностического значения при обследовании животных с подозрением на гипофизарную карликовость. Различные исследования показали, что результаты измерений базальной концентрации ГР в произвольных пробах животных с гипофизарной карликовостью в значительной мере совпадают с результатами здоровых собак. Иногда у здоровых собак концентрации ГР низкие или необнаружимые, поскольку гормон секретируется импульсами и его концентрация может оставаться очень низкой в промежутке между ними (Eigenmann, 1982b; Eigenmann et al, 1984d; Kooistra et al, 2000a; Bhatti et al, 2006c). Eigenmann, et al. (1984d) сообщили о базальных концентрациях ГР 0,48 ± 0,09 мкг/л у немецких овчарок с карликовостью и 1,5±1,2 мкг/л у здоровых собак. В исследовании Kooistra, et al. (2000a) базальные концентрации ГР варьировали от 0,3 до 1,5 мкг/л (среднее 0,5) у немецких овчарок с карликовостью и от 0,6 до 5,2 мкг/л (среднее 1,8) у здоровых биглей. Bhatti, et al. (2006c) обнаружили, что базальные концентрации ГР у немецких овчарок с карликовостью составляют от 0,4 до 1,2 мкг/л (среднее 0,7) и от 0,2 до 1,0 мкг/л (среднее 0,6) у здоровых биглей. Сообщалось, что базальные концентрации ГР у здоровых кошек составляют 3,2 ± 0,7 мкг/л (Eigenmann et al, 1984b) и 1,2 ± 1,0 мкг/л (Peterson et al, 1990).

Пробы со стимуляцией высвобождения гормона роста

Общее правило при исследовании на эндокринные заболевания заключается в том, что для подтверждения гипофункции необходим проба со стимуляцией, а гиперфункции - проба с подавлением (Eigenmann, 1982b). Соответственно, для подтверждения гипосоматотропизма требуется проба со стимуляцией. Изолированную недостаточность ГР можно доказать с помощью пробы со стимуляцией РГГР, клонидином или ксилазином. Также описана стимуляция грелином (табл. 2-1). Для диагностики сочетанной недостаточности гормонов гипофиза подходит комбинированная функциональная проба с четырьмя рилизинг-гормонами. Концентрации ГР в циркулирующей крови измеряются в образцах крови, взятых через разное время после введения стимулирующего вещества. Недостаточность ГР диагностируется, если концентрация ГР не увеличивается более определенного предельного значения. При интерпретации результатов пробы необходимо учитывать несколько важных факторов. Во-первых, недостаточность ГР может быть как полной, так и частичной. В случае полной недостаточности ГР его концентрация не увеличивается после стимуляции. Однако при частичной недостаточности можно увидеть реакцию от легкой до умеренной степени, возможную и у здоровых животных. Проблема перекрывающихся результатов определения ГР существует и в медицине, где предельное значение между нормой и отклонением остается предметом активных споров, и для постановки диагноза недостаточности ГР необходимо как минимум два исследования с провокацией для оценки резерва ГР (Cooke et al, 2011).

ТАБЛИЦА 2-1. ПРОТОКОЛЫ ПРОБ СО СТИМУЛЯЦИЕЙ ГОРМОНА РОСТА

МЕТОД	ВЕЩЕСТВО, ДОЗА, ПУТЬ ВВЕДЕНИЯ	ВРЕМЯ ОТБОРА КРОВИ (МИН.)	НОРМАЛЬНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ	НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ
Проба со стимуляцией РГГР	Человеческий РГГР, 1 мкг/кг, в/в	0*, 5, 10, 20*, 30*, 45	ГР>5 мкг/л (после стимуляции)	Не описаны
Проба со стимуляцией клонидином	Клонидин, 10 мкг/кг, в/в	0*, 15*, 30*, 45, 60, 90	ГР>10 мкг/л (после стимуляции)	Седация, брадикардия, гипотензия, головокружение, агрессивное поведение
Проба со стимуляцией ксилазином	Ксилазин, 100 мкг/кг, в/в	0*, 15*, 30*, 45, 60, 90	ГР>10 мкг/л (после стимуляции)	Седация, брадикардия, гипотензия, головокружение, агрессивное поведение
Проба со стимуляцией грелином	Человеческий грелин, 2 мкг/кг, в/в	0, 5, 10, 20*, 30*, 45	ГР>5 мкг/л (после стимуляции)	Не описаны

ГР, гормон роста; РГГР, рилизинг-гормон ГР; в/в, внутривенно.

Читателю следует принять во внимание, что исходные протоколы включают частый забор крови; чтобы решить, нормально или недостаточно высвобождение ГР, необязательно анализировать все эти образцы. Кровь следует отбирать во время максимальной реакции в виде высвобождения ГР. Следовательно, можно ограничить число образцов крови помеченными*. Подробнее об обработке образцов крови см. ниже. Также см. описание комбинированной пробы на функцию гипофиза.

Во-вторых, доступность определения ГР собак очень ограничена, так как для этого необходим видоспецифичный гомологичный метод. ГР кошек можно достоверно измерить с помощью радиоиммунологического (РИ) метода, разработанного для собак (Kooistra, 2010). До настоящего времени в ветеринарии не проводилось исследований по сравнению разных методов определения ГР. В медицине наиболее сильным мешающим фактором при оценке секреции ГР считается вариабельность результатов измерения ГР разными методами (Cooke et al, 2011). Таким образом, исключительно важно убедиться в пригодности использования метода измерения ГР для собак и кошек, а также установить специфические для каждого метода пределы нормы.

В-третьих, известно, что на выработку ГР при стимуляции влияют различные факторы; однако их значимость у собак и кошек пока не исследовалась подробно. У людей (в частности, детей с подозрением на недостаточность ГР) пробы со стимуляцией ГР следует проводить только после голодной диеты с вечера, так как углеводы и жир подавляют секрецию ГР. Ожирение также приводит к ослаблению реакции высвобождения ГР. Не стоит проводить исследование, если пациент принимает глюкокортикоиды в дозах, превышающих физиологические, поскольку эти препараты подавляют высвобождение ГР (Cooke et al, 2011; Styne, 2011). Кроме того, известно, что глюкокортикоиды отрицательно влияют на высвобождение ГР у собак. У собак с гипофизарным гиперадренокортицизмом высвобождение ГР после введения РГГР, клонидина или ксилазина подавлено (Peterson and Altszuler, 1981; Regnier and Garnier, 1995; Meij et al, 1997). Представляется вероятным, что высвобождение ГР подавляется также у животных, получающих экзогенные глюкокортикоиды. Таким образом, стимуляцию высвобождения ГР следует проводить после голодной диеты с вечера, при этом в остальное время животные должны нормально питаться и не получать глюкокортикоидов. Ни один из методов, обсуждающихся ниже, не исследовался на кошках.