Бактериологическое исследование (4 часа)

Содержание. Изучение морфологии и физиологии бактерий, методов их вы­деления и идентификации.

Материальное обеспечение. Микроскоп МББ_; МБС, иммерсионное масло, предметные и покровные стекла, предметное стекло с луночкой, вазелин, стекло со шлифованным краем, стерильные пипетки, бактериологическая петля, набор реактивов для окраски по Граму, фильтровальная бумага, кювета, чашка и «мостик» для предметных стекол, бутыль с водой, пинцет, спиртовка, спички и карандаш по стеклу.

Для бактериологического исследования берут только живую рыбу, так как у погибшей быстро развивающаяся микрофлора затрудняет выделение возбудителей болезней. При взятии материала соблюдают правила асептики.

Посуду для взятия проб (банки, колбы, пробирки, чашки Петри и др.) предварительно стерилизуют в автоклаве (при 1 атм 20-30 мин) или в сушильном шкафу (при 160-170 °С 1-1,5 ч). Ведра, кастрюли, бидоны тща­тельно промывают теплой водой с мылом, ополаскивают кипяченой водой. Перед взятием живой рыбы посуду заполняют водой из водоема, откуда берут рыбу, или из артезианской скважины. Руки тщательно моют и проти­рают тампоном, смоченным спиртом.

Морфология бактерий.Микроорганизмы можно изучать в живом и фиксированном, окра­шенном состоянии с помощью микроскопа (бактериоскопически), а также при выделении чистых культур на питательных средах (бактериологически).

Бактериоскопически изучают морфологию бактериальной клет­ки – ее форму, размеры, структуру, различные включения.

Бактерии – одноклеточные организмы, размножающиеся про­стым делением.

По морфологическим признакам бактерий делят на 3 основные формы: сферическую (шаровидную) – кокки, цилиндрическую (па­лочковидные) – бактерии, бациллы (аэробы), клостридии (анаэ­робы) и извитую – вибрионы, спириллы, лептоспиры, спирохеты. Среди кокков в зависимости от характера деления различают микро-, дипло-, стрепто-, тетра-, стафилококки и сардины.

Для бактерий характерна сложная структура, обеспечивающая многообразие их функциональной деятельности. Бактериальная клетка имеет клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, нуклеоид, цитоплазму с различными включениями. Некоторые бак­терии в организме или на искусственных питательных средах спо­собны образовывать капсулу – слизистый слой, защищающий клет­ку от высыхания и других неблагоприятных воздействий внешней среды. Бациллы и клостридии образуют споры, располагающиеся терминально, субтерминально или центрально. У бактерий, способ­ных активно двигаться, есть жгутики, количество и расположение которых являются важным диагностическим признаком. Жгутики могут располагаться полярно (монотрихи – один жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков) или по всей поверхности клетки (перитрихи). Однако не все бактерии, не имеющие жгутиков, явля­ются неподвижными. Безжгутиковые миксобактерии, выделяя огромное количество слизи, обладают способностью к скользящему движению.

В лаборатории вначале делают первичные посевы на питательные среды (мясо-пептонный бульон МПБ и мясо-пептонный агар МПА).

Прежде всего, исследуют материал, взятый из пораженных участков (язвы, абсцессы и т.п.). Перед взятием соскоба язвы промывают стериль­ным физиологическим раствором. Содержимое абсцессов набирают пастеров­ской пипеткой после прижигания шпателем места взятия. Кровь для посевов берут из сердца или хвостовой артерии. Первую каплю крови удаляют, а по­следующие 2-3 высевают на питательную среду.

Непосредственно перед вскрытием инструменты (скальпель, ножницы, пинцеты и др.) кипятят в течение 30 мин. Перед взятием материала для бактериологического исследования их дополнительно смачивают денатуриро­ванным спиртом и обжигают на пламени горелки.

Для бактериологического исследования высев на питательные среды делают из сердца, селезенки, почек и других органов. Перед взятием место прокола предварительно обеззараживают нагретым металлическим шпателем. Для взятия крови из сердца органы брюшной полости отодвигают в сторону, освобождают перегородку сердечной полости и оттянутым концом пастеров­ской пипетки прокалывают сердечную мышцу.

Для идентификации возбудителей бактериальных болезней изучают их морфологию, подвижность, культуральные, биохимические свойства.

Микроорганизмы можно изучать в живом, фиксированном состоянии, при выделении чистых культур на питательных средах.

Определяют форму, размеры, структуру, подвижность бактерий.

Подвижность живых бактерий можно изучать на полужидком агаре (неподвижные бактерии растут строго по уколу, подвиж­ные – по всей среде, вызывая ее помутнение) или по методу «вися­чей» и «раздавленной» капли

Метод «висячей» капли. Края чистого покровного стекла сма­зывают вазелином, в центр наносят каплю суточной бактериаль­ной культуры (лучше бульонной) и накрывают предметным стеклом с луночкой так, чтобы капля находилась в центре лунки. Затем препарат быстро переворачивают покровным стеклом вверх так, чтобы капля провисла над лункой, не касаясь дна и краев. При малом увеличении находят край капли, устанавливают большое увеличение, микроскопируют при слегка опущенном конденсоре.

Метод «раздавленной» капли. На поверхность чистого предмет­ного стекла наносят каплю суточной бульонной культуры и осто­рожно накрывают покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха и капля не выходила за края покровного стекла. Микро­скопируют при большом увеличении и опущенном конденсоре.

Для изучения морфологии бактерий из них готовят фиксиро­ванные мазки и окрашивают.

Различают простые и сложные методы окраски. При простых методах окраски используют один краситель, чаще всего метиле­новый синий или основной фуксин, когда нужно убедиться в чисто­те бактериальной культуры или изучить морфологию клетки Сложные методы окраски, включающие несколько этапов с исполь­зованием различных красителей, позволяют изучить структуру бактериальной клетки.

1Приготовление фиксированных препаратов. На чистое обез­жиренное предметное стекло наносят каплю воды или физиологи­ческого раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и осторожно круговыми движениями равномерно тонким слоем распределяют по поверхности стекла, чтобы получился мазок диа­метром 1-1,5 см. Бульонную культуру наносят и равномерно распределяют по стеклу с помощью пастеровской пипетки.

При исследовании крови, взятой из сердца или хвостовой вены, первую каплю стряхивают, а вторую наносят на поверхность пред­метного стекла ближе к правому краю. Затем стеклом со шлифо­ванным краем под углом 45° прикасаются к капле крови, чтобы она растекалась по внутреннему краю стекла, и движением шлифо­ванного стекла влево растирают каплю. Получается тонкий равно­мерный мазок крови.

Для получения мазков-отпечатков из паренхиматозных органов отрезанный кусочек органа, который держат пинцетом, проводят сквозь пламя спиртовки, чтобы запеклась «корочка». Затем стериль­ным скальпелем рассекают кусочек и свежесрезанной поверхностью несколько раз прикасаются к предметному стеклу. На одном стекле можно получить до 8 мазков-отпечатков.

Мазок высушивают на воздухе, затем фиксируют над пламенем горелки или в спирт-эфире (этиловый спирт + эфир 1:1) 20 мин, спирте с формали­ном (5 мл 40 %-ного формалина, 9,5 мл 96 %-ного этилового спирта) – 15 мин, ацетоне – 5 мин, хлороформе – несколько секунд.

2 Окраска мазков. Высушенные и зафиксированные мазки окрашивают по Граму, Цилю-Нильсену, Романовскому-Гимза, Михину или другими методами. При вы­боре метода выделения и культивирования возбудителя учитывают анамне­стические и эпизоотологические данные, результаты клинического исследова­ния. Так, при наличии большого количества слизи на жабрах, спине, хвосто­вом плавнике проводят исследования на миксобактериоз. В этом случае делают высев на чашки Петри с цитофагаагаром. Большинство возбудителей болезней рыб хорошо растут на обычных мясо-пептонных средах.

При выделении анаэробных культур из питательных сред удаляют растворенный кислород. Анаэробные условия создаются в средах, налитых вы­соким столбиком, покрытых слоем растительного масла толщиной 6–8 см (печеночный бульон, Среда Кита-Тароцци и др.). Для удаления растворен­ного кислорода жидкие питательные среды перед посевами кипятят в про­бирках на водяной бане в течение 10 мин.

Окраска по Граму. На фиксированный препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и на 1-2 мин наносят избыток раствора генцианвиолета или кристаллвиолета. Снимают фильтро­вальную бумагу, сливают краску и, не промывая, наливают раст­вор Люголя до полного почернения препарата. Сливают раствор Люголя, пинцетом берут препарат за край стекла и погружают в стаканчик со спиртом, затем поднимают и опускают стекло до прекращения появления струек краски. Мазок тщательно промы­вают водой. В течение 2-3 мин докрашивают мазок фуксином Пфейфера. Сливают краску, мазок тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Грамположительные микробы, содержащие в цитоплазме боль­ше РНК и белков, при обработке генцианвиолетом и раствором Люголя образуют с белками цитоплазмы прочное содинение краси­теля и йода, не обесцвечивающееся спиртом. Поэтому грамположи­тельные микробы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грам­отрицательные микробы, обесцвечивающиеся спиртом, докраши­ваются фуксином в розово-красный цвет.

Физиология бактерий. По типу питания патогенные для рыб бактерии относятся к гетеротрофам – микроорганизмам, исполь­зующим в качестве источника углерода только готовые для усвое­ния органические соединения. Гетеротрофы могут быть сапрофитами, живущими и развивающимися на мертвых органических суб­стратах, и паразитами, живущими и размножающимися в живых организмах. В зависимости от условий существования одни и те же микроорганизмы могут быть то сапрофитами, то паразитами, по­этому четкой границы между ними провести нельзя.

По характеру дыхания все микробы делятся на аэробы и ана­эробы.

У аэробов процесс дыхания протекает по типу окислительной реакции, для чего необходим кислород.

Анаэробы необходимую для жизнедеятельности энергию полу­чают при расщеплении органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды.

Существуют облигатные (строгие) аэробы (возбудитель холе­ры) и анаэробы (возбудитель газовой гангрены), которые могут развиваться только в аэробных или анаэробных условиях, и фа­культативные анаэробы, которые в зависимости от условий обита­ния могут менять аэробный тип дыхания на анаэробный. К этой группе относится большинство возбудителей болезней рыб.

Выделение и идентификация бактерий. Выбор метода куль­тивирования бактерий зависит от типа питания и дыхания. Для определения видовой принадлежности возбудителя недостаточно одного микроскопирования: необходимо выделить и провести иден­тификацию чистой культуры.

Микроорганизмы, выращенные из одной колонии на плотной или жидкой питательной среде, называют чистой культурой. Изо­лированное скопление бактерий одного вида на плотной питатель­ной среде, образовавшееся при размножении нескольких клеток, называют колонией. Культуры микробов одного вида, выделенные из одного или разных источников, называют штаммами. Совокуп­ность микроорганизмов, имеющих единые происхождение и гено­тип, сходных по морфологическим и функциональным признакам, называют видом. Внутри одного вида могут быть разновидности микроорганизмов, отличающиеся друг от друга по некоторым при­знакам: типы, подвиды или варианты.

Систематическое положение бактериальной культуры устанав­ливают, изучая ее таксономические свойства: морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные, антигенные и др.

Морфологические и тинкториальные свойства бактерий изучают при микроскопии мазков, окрашенных различными методами.

Культуральные свойства характеризуют по росту бактерий на различных плотных и жидких питательных средах. Колонии микро­организмов, вырастающие на плотных питательных средах, харак­теризуют по величине (крупные, средние, мелкие, росинчатые), форме (круглые, неправильной формы, многолопастные), прозрач­ности (прозрачные, полупрозрачные), цвету (матовые, с пигмен­том), влажности (сухие, влажные, слизистые), поверхности (плос­кие, вогнутые, выпуклые, плосковыпуклые, гладкие, морщинистые, исчерченные), структуре и консистенции (аморфная, зернистая, во­локнистая, плотная, мягкая) и др.

На скошенном питательном агаре рост может быть влажным, ползучим, сухим, морщинистым, слизистым, пигментированным; на МПБ – диффузным, придонным, пристеночным, с образованием пленки (тонкой, морщинистой, с «тяжами», спадающей вниз), осад­ка (в виде комочка ваты, аморфного).

Ферментативные свойства (в основном сахаролитические и про- теолитические) изучают на различных дифференциально-диагно­стических средах (среды Гисса, МПЖ – мясопептонный желатин, лакмусовое молоко и др.).

В лабораторной практике для производства посевов на пита­тельные среды чаще всего используют бактериологическую петлю из платиновой или нихромовой проволоки длиной 6-8 см, один конец которой загнут в виде небольшой (1,5-2 мм) петли, другой зажат в специальном петледержателе. Бактериологической петлей можно делать посевы как на плотные, так и на жидкие среды в чашках Петри и пробирках. Кроме петли посев на плотные среды в чашках Петри можно осуществлять с помощью стеклянного и металлического шпаделей, на жидкие среды – с помощью пасте­ровских или градуированных пипеток.

Выделение чистых культур микробов. Берут стерильную жидкость (бульон, физиологический раствор и т.п.) и готовят слегка опалесцируюшую микробную взвесь, которую высевают на твердую питательную среду (МПА рН 7,2-7,6). Каплю посевного материала наносят на поверхность агара в чашке и распределяют стеклянным шпателем.

Можно применить дробный высев. Делают это так: на поверхность агара первой чашки наносят каплю агаровой взвеси, а затем петлей или шпа­телем (без добавления культуры) материал последовательно распределяют по нескольким чашкам. Засеянные чашки с агаром помещают на 24-48 ч в термостат, а чашки с желатиной оставляют при комнатной температуре. Выросшие в чашках отдельные колонии просматривают под лупой или ма­лом увеличении микроскопа, нужные отмечают и пересевают на питательные среды в пробирки. Чтобы убедиться в чистоте культуры, материал с одной колонии разбавляют в стерильной жидкости и вновь высевают на чашки с агаром.

Чистую культуру после макро- и микроскопической проверки изучают. Для этого исследуют ее морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, серологические и биохимические свойства по схеме:

1) морфология (микроскопия окрашенных микробов);

2) подвижность (микроскопия микробов в живом состоянии методом
висячей или раздавленной капли);

3) форма и расположение жгутиков (окраска препаратов);

4) отношение к окраске по Граму (грамположительные или грамотрицательные);

5) реакция на цитохромоксидазу;

6) споры (окраска препарата);

7) капсулы (окраска препарата);

8) бульон (прозрачность или мутность, пленка, осадок, цвет среды, запах);

9) скошенный агар (мощность роста – отсутствует, слабая, умеренная;
характер роста – нитевидный, волнистый, мелкозубчатый, лопастной, ворсистый; блеск – влажный, жирный, тусклый; поверхность – гладкая, шероховатая, зернистая, складчатая, сухая, влажная; рельеф – плоский, выпуклый; прозрачность – непросвечивающнйся, просвечивающийся, опалесцирующий; консистенция – маслянистая, тягучая, крошковатая; цвет посевной, черты – пигментация; окраска среды – зеленая, сине-зеленая и т. д.);

10) колонии на агаре в бактериологических чашках (рост – скудный, умеренный, обильный; величина – крупные, мелкие, точечные; форма – круг­лая, эллипсовидная, корневидная; структура – волокнистая, хлопьевидная; характер края – волнистый, ровный, изрезанный, бахромчатый, локонообразный и т.д.; цвет колонии – пигментация; окраска среды; запах – отсутст­вует, резкий, что напоминает);

11) желатина в бактериологических чашках (разжижена или нет; харак­тер разжижения; дальнейшее описание морфологии колонии ведут как на агаре);

12) желатина, посев уколом (характер роста по уколу – в виде ленты, нити, гвоздя с головкой, равномерный, прерывистый, только поверхностный; разжижение ­– в виде чашечки, воронки, цилиндра, кратера, поверхностное, пузырчатое – в глубине; скорость разжижения – быстро, медленно; окраска среды – зеленая, синяя и т.д.);

13) лакмусовое молоко (реакция – кислая, щелочная, без изменений; свертывание; сгущение; пептонизация);

14) картофель (интенсивность и характер роста, цвет пигмента);

15) ферментация углеводов (быстрота и степень кислото- и газообразо­вания при росте на средах Гисса и Хью-Лейфсона);

16) образование ацетилметилкарбинола (к 1 мл 2-3-суточной культуры на среде Кларка прибавляют 0,5 мл 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола и 1 мл 16 %-ного водного раствора NaOH. При положительной реакции через 3-5 мин среда приобретает вишневый цвет);

17) образование индола (экстрагирование индола, путем прибавления 1-2 мл эфира к 3–5 мл 3–5-суточной культуры на мясо-пептонном бульоне или бульоне Хоттингера, затем прибавляют реактив Эрлиха-Боме, который в присутствии индола окрашивает вытяжку эфира в красный цвет);

18) образование сероводорода (фильтровальная бумага, смоченная рас­твором уксуснокислого свинца и фиксированная в пробирке с мясо-пептонным бульоном, сразу же после засева в присутствии сероводорода чернеет или буреет);

19) образование аммиака (фильтровальная бумага, заранее обработан­ная реактивом Несслера или Крупа и фиксированная в пробирке с только что засеянной средой, обычно уже через сутки инкубирования посевов в при­сутствии аммиака буреет или краснеет);

20) редукция нитратов (при редукции нитратов в нитриты получается темно-синее окрашивание 2-3-суточной бульонной культуры с 0,2 % калийной селитры в результате прибавления к культуре 10%-ного водного рас­твора крахмала с йодистым калием и 10 %-ного водного раствора химически чистой серной кислоты);

21) гидролиз крахмала (на поверхность 0,2 %-ного крахмального агара б бактериологических чашках с 2-3-суточной культурой наливают насыщен­ный и профильтрованный раствор кристаллического йода в 50 %-ном спирте; при рассмотрении чашки в проходящем свете вокруг колоний бактерий, расщепляющих крахмал, можно обнаружить светлые зоны);

22) редуцирующая способность (посев уколом в агар с метиленовой синькой и другими красками);

23) отношение к кислороду (выдерживают посевы в аэробных и анаэроб­ных условиях);

24) гемолизируюшие свойства (посев на мясо-пептонный агар с 5-10 % дефибрннированной крови барана, кролика или лошади);

25) температурный оптимум (определяют быстроту и интенсивность
роста микробов, выдерживая посевы при различной температуре).

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Чувствитель­ность микроорганизмов к антибиотикам определяют методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков на плотных пита­тельных средах (МПА и кровяном агаре). Стандартные диски диаметром 5 мм готовят на специальной фильтровальной бумаге, пропитанной анти­биотиками и окрашенной в контрастные цвета.

В стеклянные чашки Петри наливают 2 % МПА или кровяной агар толщиной 4-5 мм. Чашки слегка подсушивают в термостате. В зависимости от интенсивности роста исследуемой культуры ее используют после 1-3-суточного инкубирования при оптимальной температуре на МПА или МПБ. Из агаровых культур с помощью физиологического раствора готовят 10^-8 бактериальную взвесь.

На поверхность подсушенной среды наносят несколько миллилитров ис­следуемой культуры, равномерно распределяют по поверхности среды, избы­ток культуры отсасывают пастеровской пипеткой. Через 30-40 мин на по­верхность среды стерильным остроконечным пинцетом накладывают диски с антибиотиками, слегка придавливая к агару. Диски располагают на рас­стоянии 2-2,5 см один от другого и от края чашки. Чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат на 1-2 сут при температуре инкуби­рования, оптимальной для данного микроба.

Диффундируя в агар, антибиотик образует вокруг диска зону угнетения роста чувствительных к нему бактерий. Зоны угнетения измеряют полоской миллиметровой бумаги. Учитывают диаметр зоны, проходящей через центр диска: при диаметре зоны угнетения роста менее 11 мм – бактерии рези­стентные или слабочувствительные, 11-20 мм – чувствительные и более 20 мм – высокочувствительные.

Контрольные вопросы.

1 Методы изучения микроорганизмов.

2 Что такое бактерии?

3 Строение бактерий.

4 Каким образом осуществляется движение бактерий?

5 Каковы методы окраски бактерий?

6 Как изучить подвижность бактерий?

7 Как приготовить микроскопический препарат?

8 Характер питания патогенных для рыб бактерий.

9 Типы дыхания бактерий.

10 Дать характеристику вида, штамма, чистой культуры, колонии.

11 Методика посева на плотные и жидкие питательные среды.

12 Каковы этапы бактериологического исследования?

13 Методика получения изолированных колоний.