Генетические исследования условной реакции активного избегания

Активное избегание удара электрического тока в челночной камере (см. гл. 3)— это четкий тест на обучаемость у лабораторных грызунов, показатели которого легко измерить. Он достаточно унифицирован и

его результаты, полученные в разных лабораториях, легко сопоставить друг с другом. Поскольку в качестве условного раздражителя можно выбрать звук, то тест позволяет включать в сравнение и животных-аль­биносов, не опасаясь, что свойственная им низкая острота зрения по­влияет на успешность выполнения навыка.

В начале 60-х годов на основе популяции крыс Вистар итальянс­кий исследователь Дж. Биньями начал селекцию на высокую и низ­кую способность крыс к обучению реакции активного избегания в челночной камере. Уже через несколько лет между селектированными линиями существовали достоверные различия в обучаемости: линии были сформированы. Они получили название Римских (Roman High Avoidance, RHA, Roman Low Avoidance, RLA). С начала 70-х годов селекция и разведе­ние этих крыс проводились независимо в нескольких лабораториях раз­ных стран (Driscoll, Battig, 1982; Fernandez-Teruel et al., 1997).

Исследование крыс Римских линий с помощью практически всех существующих методик оценки поведения дало основание считать, что наиболее сильные межлинейные различия у RHA и RLA связаны с эмоциональностью и разным типом реакции крыс двух линий на стрессоры.

Эти линии тем не менее все же различаются и по способности к ассоциативному обучению как таковой.

В 70-е годы путем селекции были созданы еще две линии крыс — Сиракузские (Syracuse High Avoidance, SHA, Syracuse Low Avoidance, SLA). Они, как и Римские линии, достоверно различались по скорости ус­воения реакции активного избегания, но (в отличие от Римских), не различались по уровню двигательной активности. Исходной популя­цией для этой селекционной работы послужили крысы Лонг-Шанс. В настоящее время крысы хорошо обучающейся линии 577Адают при­мерно 40 реакций избегания в 60 предъявлениях теста, тогда как SLA — ни одной. У плохо обучающейся линии SLA было мало межсигнальных реакций, однако скорость выполнения реакций избавления (т.е. реак­ции на включение собственно болевого стимула — электрического тока) у них не отличалась от линии SHA. Иными словами, межлиней­ные различия обнаруживались в «готовности» к выполнению перехода из одной половины камеры в другую, но не затрагивали реакции на боль. В тесте «открытого поля» у Сиракузских, так же как у Римских линий, различался уровень возбудимости вегетативной нервной сис­темы. Речь идет о так называемой «эмоциональности» крыс, которая оценивается по числу болюсов дефекации при помещении животного в новую, слегка пугающую обстановку теста «открытого поля». SLA, так же как и RLA, оказались более «эмоциональными», т.е. испуг у них был сильнее.

В Возможно, что менее эффективное обучение реакции избега­ния, общее для линий RLA и SLA, имеет одну причину — повы-

В" шенную пугливость этих животных, которая препятствует образова­нию ассоциации между условным сигналом и реакцией животного.

Различия в процессах обучения и памяти в связи с генетической изменчивостью строения мозга. В соответствии с традиционно приня­той в нейрофизиологии логикой исследований функциональную роль того или иного отдела мозга в формировании поведения обычно ана­лизировали путем оценки последствий его разрушения, а также элек­трической и/или фармакологической стимуляции.

К началу 70-х годов считалось установленным, что одна из функ­ций гиппокампа (рис. 9.2А) — мощное модулирующее влияние на процессы обучения, в частности торможение инструментальных ус-ловнорефлекторных реакций (Виноградова, 1975).

Американские исследователи Р. и Ц. Ваймеры и Т. Родерик выпол­нили исследование, в котором анализировалась роль генотипических особенностей в обеспечении функции гиппокампа. Способность мы­шей генетически гетерогенной популяции к обучению пассивной ре­акции избегания удара электрического тока (при однократном его применении) авторы сопоставили с общим объемом гиппокампа, который определяли после окончания экспериментов. Для этого на срезах мозга каждого животного, прошедшего тест на обучение, оп­ределили площадь, занимаемую гиппокампом, а затем в соответствии с существующими морфометрическими правилами вычислили его суммарный объем (Wimer et al., 1971).

^в Сопоставление результатов опытов с поведением и данными | подсчетов показало, что чем больше был размер гиппокампа, тем в эффективнее данное животное обучалось пассивному избеганию.

Коэффициенты корреляции достоверно свидетельствовали о том, что размер гиппокампа (а возможно, какого-то из его отделов) опре­деляет особенности выполнения выученного навыка (т.е. обучения как такового). Очень важно, что такая корреляция была получена в экспе­рименте без применения инвазивных методов, т.е.без прямого нару­шения целостности мозга. Кроме того, поскольку исследуемая попу­ляция мышей была генетически высокогетерогенной, можно было предположить, что обнаруженная скореллированная изменчивостьобо­их признаков (размер гиппокампа и эффективность научения) по край­ней мере частично имела генетическую основу.

Морфометрические исследования (т.е. количественная оценка об­щих размеров) ряда отделов гиппокампа у мышей и крыс разных генотипов подтвердили существование достоверных межлинейных различий. Первоначально для анализа была выбрана условная реакция избегания в челночной камере (см. 3.2.2). Индивидуальную изменчи­вость темпов обучения этой реакции исследователи рассматривали как зависимую переменную (см.: Li рр etal., 1989; Schwegler, Lipp, 1995). В качестве независимой взяли вариабельность зоны окончания мшис-

Рис. 9.2. Роль размера проекционной зоны iipMF гиппокампа мышей в формировании пространственного навыка поиска пищи в радиаль­ном лабиринте.

А — схема строения гиппокампа; толстой стрелкой показана зона окончания iipMF; Б — слева: схема последовательных посещений мышью лучей радиаль­ного лабиринта, содержащих приманку, с небольшим числом повторных, ошибочных заходов; справа: график, отражающий зависимость между чис­лом ошибочных заходов на 5-й день теста у мышей ряда инбредных линий, различающихся (нижняя схема) по относительному размеру проекции iipMF, который отложен по оси абсцисс графика (по: Lipp, Wolfer. 1995).

тых волокон, аксонов гранулярных клеток зубчатой фасции гиппокампа на базальных дендритах пирамидных нейронов поля САЗ (рис. 9.2А). Мши­стые волокна оканчиваются в пирамидном слое поля САЗ крупными синаптическими бляшками. Зоны их окончаний формируют два чет­ких синаптических поля, т.е. две области проекции. Одна из них рас­полагается непосредственно над. пирамидными нейронами поля САЗ и называется супрапирамидным слоем. Вторая, меньшая по объему, рас­полагается ниже или внутри слоя пирамидных клеток. Эта область назы­вается слоем интра- и инфрапирамидных мшистых волокон, iipMF. Избирательная окраска именно этой структуры (метод Тимма) позво-пяет с высокой точностью определить ее размеры. У крыс Римских ли­ний (см. выше), резко различающихся по скорости формирования на­выка избегания удара тока, была выявлена отрицательная корреляция между площадью проекции мшистых волокон iipMF и способностью к обучению этой реакции. У мышей ряда инбредных линий, в том числе линий DBA/2J, СЗН/Не (размеры их зон проекций мшистых волокон схематически представлены на рис. 9.2Б справа), также была обнару­жена сильная и высокодостоверная отрицательная (-0,92) корреля­ция площади UpMFn показателей обучения в челночной камере. У гиб­ридов второго поколения от скрещивания этих линий корреляция мо­жет сохраниться только в случае, если ассоциация обоих признаков неслучайна. В эксперименте индивидуальная корреляция способности к обучению и площади iipMF у гибридов оказалась высокой.

^Е На большом и разнообразном экспериментальном материале | было показано, что крысы и мыши тем лучше обучаются данному в навыку, чем меньше у них площадь iipMF.

Напомним, что выработка навыка избегания наказания в челноч­ной камере — это типично лабораторный тест, аналога которому в естественном поведении грызунов практически нет. Его отрицатель­ная корреляция с размером определенного отдела мозга еще ничего не говорит о функциональной значимости этой структуры. В этом от­ношении значительно больший интерес представляло исследование таких же корреляций в тестах, более адекватных экологической спе­циализации крыс и мышей.

Для выяснения участия генотипа в формировании когнитивных спо­собностей животных более информативными оказались данные о кор­реляции размера iipMF с успешностью формирования навыка обучения в радиальном лабиринте (см. 3.4.2.1), которое требует формирования про­странственных представлений (формирования «мысленного плана» ла­биринта, см. 3.4). В таких экспериментах была обнаружена достоверная положительная корреляция размера iipMF и обучаемости мышей про­странственному навыку (Schwegler, Lipp, 1995). На рис. 9.2Б слева по­казана схема перемещения мыши по радиальному лабиринту при реше­нии задачи, а также график зависимости успешности выполнения на­выка от размеров данной зоны синаптических окончаний. Под графиком схематически изображены размеры проекций мшистых волокон у мы­шей двух линий (см. выше). Выполнение теста Морриса (обучение в водном лабиринте, см. 3.4.2.2), точнее, «прочность» сформированной пространственной памяти, положительно коррелирует с размером iipMF (Schwegler, Lipp, 1995).

g Тесты на способность к обучению на основе формирования представления о пространстве и о своем положении в нем живот­ные усваивают тем успешнее, чем больше у них размер проекции мшистых волокон гранулярных клеток на базальныхдендритах пи­рамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.

Были проанализированы корреляции успешности выполнения «про­странственных» и непространственных тестов с размерами и других об­ластей гиппокампа (не только с iipMF), однако таких фенотипических корреляций с толщиной отдельных слоев гиппокампа в его разных уча­стках, т.е. с числом клеточных элементов и мощностью дендритных ство­лов пирамидных клеток, не обнаружено (Schwegler, Lipp, 1995).

|] Итак, обнаруженные нейроморфологические и поведенческие корреляции дают основание утверждать, что данная область си­наптических окончаний (соединяющая гиппокамп с областью эн-торинальной коры и с новой корой) играет принципиально важ-ную, ключевую роль в осуществлении и/или модуляции процес-

li сов обучения разных типов.

Эти результаты были получены благодаря широкому использова­нию в лабораторных тестах генетически охарактеризованных живот-

ных, а также применению основных методов анализа генетических различий. В настоящее время исследование когнитивных способностей животных в этом тесте является одним из ведущих подходов в оценке особенностей поведения трансгенных животных и мышей-нокаутов. Детальнее с этими вопросами можно познакомиться в работе Lipp, Wolfer (1998), а также в материалах симпозиума «Behavioral Phenotyping of Mouse Mutants» (Cologne, 2000).

Использование трансгенных мышей при исследовании роли генотипа в процессах обучения и памяти. Методы генной инженерии и молеку­лярной биологии сделали возможным получение так называемыхтранс­генных животных. Как говорилось выше, такие исследования — это реализация подхода «от гена к поведению». Как правило, это физиоло­гический и биохимический анализ, а также исследование поведения искусственных мутантов, у которых был видоизменен определенный участок генома. Для их создания в геном животного (в настоящее время используются почти исключительно мыши) вводится новый генети­ческий материал. Таким материалом может быть или участок ДНК, ко­дирующий измененный ген, уже имеющийся у реципиента, ген от жи-ютного другого вида (например, крысы), либо генетическая конструк­ция, которая выключает какой-либо из генов реципиента (см.: Льюин, 1987; Jones, Mormede, 1999).

Выделенный фрагмент ДН К вводится в геном на ранней стадии эмбри­онального развития. С методами введения можно ознакомиться в специальных руководствах. В результате соответствующих манипуляций формируются так называемые химерные животные. Нередко оказывается, что гомозиготные по новой мутации особи (мыши с обоими мутантными аллеями) нежизнеспо­собны, и ее удается поддерживать только в гетерозиготном состоянии. Однако чаще всего популяция трансгенных мышей представляет собой смесь из жи­вотных дикого типа (гомозиготных по нормальному аллелю гена), гетерози-готных особей (имеющих один нормальный и один мутантный аллель) и го­мозиготных по мутантному аллелю. Генотип каждого животного можно опре­делить методом полимеразной цепной реакции или иным методом, подвергнув анализу небольшой кусочек ткани животного (обычно для этого отрезают кончик хвоста). Иногда гомозиготные носители нового гена внешне отлича­ются от нормальных собратьев.

Специальные молекулярно-биологические приемы должны обеспечить до­статочно надежную экспрессию новой ДНК в геноме реципиента. В против­ном случае введенный в геном фрагмент может сохраняться в латентном виде, не обнаруживая себя.

Наиболее часто эксперименты по получению искусственных мутан­тов или животных-нокаутов проводятся с целью выяснить роль в орга­низме того или иного белка, чаще всего обладающего ферментативной активностью, или белков-рецепторов клеточной поверхности. При ра­боте с нейрогенами, т.е. с генами, которые экспрессируются («работа­ют») в мозге, наибольшее число исследований проведено с выключе­нием белков-рецепторов, избирательно связывающихся с нейромедиа-торами и другими молекулами, влияющими на режим синаптической

передачи в нейронах разных структур мозга. В настоящее время насчиты­вается много сотен мышей-нокаутов с инактивированными генами раз­ных функциональных групп, и их число продолжает расти.

Рассмотрим результаты наиболее известных исследований, в ко­торых оценивали влияние выключения нейрогенов на процессы обу­чения и памяти.

Экспериментальные схемы обучения, которые используются для тестирования запоминания у лабораторных мышей и крыс, позволя­ют с большой надежностью проанализировать влияние какого-либо фактора на краткосрочную или долгосрочную память и на процесс собственно усвоения навыка. В качестве «навыка» обычно выбирают выполнение животным простой двигательной реакции или, наобо­рот, невыполнение (торможение) такой реакции. В целях большей четкости эксперимент строят таким образом, чтобы усвоение навыка происходило при единственном сочетании условного и безусловного раздражителей. Достаточно популярны в таких исследованиях оценка синаптической проводимости гиппокампа электрофизиологическими методами и формирования пространственного навыка в тесте Морриса.

Долговременная посттетаническая потенциация. Важным модельным объектом для изучения процесса обучения стала так называемая долго­временнаяпосттетаническая потенциация (long term potentiation, LTP).

LTP — это одно из проявлений синаптической пластичности (т.е. изменения проводимости синапсов), происходящее в результате дли­тельной бомбардировки слоя пирамидных нейронов гиппокампа (об­ласть СА1) электрическим раздражением аксонов, оканчивающих­ся на этих нейронах (т.е. искусственным путем).

Подобные эксперименты в большинстве случаев проводятся на так называемых переживающих срезах гиппокампа, помещенных в специаль­ную питательную среду, т.е. in vitro. В результате потенциации клетки гиппокампа начинают активно реагировать на раздражения, неэффек­тивные до нанесения электрической стимуляции. Для этого процесса (как и для разных форм обучения) необходим целый ряд условий:

• активация так называемых NMDA-рецепторов (т.е. белковых мо­лекул, расположенных в мембране нейронов и изменяющих ее проводимость при соединении с М-метил-О-аспартатом, ~ ве­ществом, имитирующим эффект нейромедиатора);

• повышение внутриклеточного уровня ионов кальция (Са^), что в свою очередь обеспечивается определенным каскадом событий с участием системы так называемых вторичных посредников (цик­лического аденозинмонофосфата — С-АМР и др.);

• участие ряда ключевых ферментов (протеинкиназа- С, Сй^-калмо-дулинзависимая протеинкиназаII — СаМКИн тирозинкиназа).

Течение LTP в гиппокампе мышей-нокаутов с выключенны­ми генами, кодирующими такие белки, сильно видоизменялось, однако она полностью не исчезала. Одновременно у этих мышей было нарушено формирование пространственного навыка в тесте g Морриса.

Гистологическое исследование гиппокампа показало у них нару­шения в расположении гранулярных клеток зубчатой фасции, т.е. тех нейронов, аксоны которых образуют iipMF.

I) Мыши с искусственной мутацией гена Со MKII нормально обу­чались навыку отыскания безопасного убежища при наличии сиг­нальных раздражителей, но не могли усвоить этот навык, когда для этого требовалось формирование пространственных представ-

В лений, т.е. «пространственной карты» (см. 3.4).

К тому же у них при ритмическом электрическом раздражении гиппо­кампа с частотой 5—10 в сек (т.е. с частотой тета-ритма, как правило, присут­ствующего в суммарной электрической активности гиппокампа при исследо­вательском поведении) LTP не наступала, в то время как при высокочастот­ном раздражении она развивалась нормально. В норме у мышей могут развиваться обе формы LTP.

Можно проанализировать, как сказывается на процессе обучения противоположное генетическое изменение — «сверхэкспрессия» како­го-либо гена. Специальными приемами можно усилить работу гена не во всем мозге, а только в определенных его участках. Такие вполне жизнеспособные животные демонстрируют поразительные видоизме­нения поведения (Mayford et al., 1995).

ез Сверхпродукция белка NMDA-рецептора типа 2В в переднем

Е мозге мутантных мышей сопровождалась резким усилением спо-р собности к обучению в ряде тестов (так же как и усилением LTP).

Мутантные мыши превосходили контрольных по усвоению навыка «застывания» (freezing response) при тестировании после однократно­го применения удара электрического тока, и у них было более прочное запоминание этой условной реакции. Обучение в тесте Морриса у этих мышей также было более эффективным. Данные наблюдения позволя­ют сделать вывод, важный для нейрофизиологии обучения:

В изменение эффективности NMDA-проводимости (и видимо, изменение интенсивности последующих процессов в нейроне) одинаково влияет на формирование разных навыков и, следова­тельно, представляет собой одно из универсальных звеньев в про-

С цессе обучения.

Известно, что формирование памяти — это ступенчатый процесс.

На животных разного филогенетического уровня показано, что в этом

процессе выделяются по меньшей мере две четкие стадии:

* краткосрочная память, которая не страдает от введения веществ подавляющих синтез белка или образование молекулРНК;

* долгосрочная память — ее формирование может быть блокиро­вано введением этих веществ.

Переход от краткосрочной памяти к долгосрочной —консолида­ция — сопровождается активацией генетического аппарата илиэкспрес­сией новых генов, которые до этого были неактивны (репрессированы).

Считается установленным, что долговременная память связана с изменениями в структуре синоптических белков. Такие изменения осу­ществляются в результате целого каскада событий, принципиальным моментом которых является фосфорилирование, т.е. присоединение радикала неорганического фосфата к целому ряду белков. Этот биохи­мический процесс напрямую связан с изменениями в синапсах при их активации, он универсален и, как говорилось выше, принципи­ально сходен у животных разного уровня эволюционного развития. Выключение из каскада одного из его звеньев (путем «нокаута» соот­ветствующего гена или, наоборот, усиления его работы) дает воз­можность оценить изменения в процессах собственно «следа» памяти.

Одним из наиболее известных примеров таких изменений у мы­шей-нокаутов является выключение гена, кодирующего белок CREB (Bourchaladze et al., 1994). CREB (c-AMP response element binding protein) относится к так называемым факторам транскрипции, или регулятор-ным белкам.

Е Мыши-нокауты по гену CREB достаточно эффективно обуча­лись и хорошо запоминали навык в интервалах «работы» краткосроч­ной памяти (30 и 60 мин после сеанса обучения). Если же сохранение навыка тестировали в сроки, когда должна «работать» долгосрочная память (через 2 ч), то его воспроизведение было сильно нарушено.

Кроме этого, долговременная потенциация (LTP) у мышей с от­сутствием гена, кодирующего белок CREB, развивалась аномально в тех же временных пределах. Через 2 ч после воздействия, вызывающего LTP, в срезах гиппокампа таких животных все ее проявления уже от­сутствуют, тогда как в срезах мозга нормальных мышей сохраняются.

Совокупность данных, полученных на животных разного уровня развития, позволяет в настоящее время считать, что экспрессия транс­крипционного фактора CREB, который активирует гены, прямо свя­занные с формированием памяти, и ряда других генетических эле­ментов является важным этапом записи следа памяти в мозге.