Основы клинической иммунологии
●
Иммунология как наука изучает закономерности генетических, клеточных и молекулярных ответных реакций организма на антигены — микроорганизмы, генетически чужеродные ткани, клетки метаболиты чужеродных клеток (белки, нуклеопротеиды, полисахариды и др., в том числе синтезированные искусственно), а также аутоантигены, образующиеся в собственном организме при патологических состояниях, осуществляемые иммунной системой организма.
Иммунная система ответственна за защиту организма от паразитов, бактерий, вирусов, элиминацию мутированных и отмирающих клеток, противораковую устойчивость. Иммунные реакции лежат в основе несовместимости и отторжения донорских органов и тканей. При извращении функции иммунной системы развиваются аутоиммунные болезни, аллергии, некоторые болезни антенатального периода, канцерогенез, преждевременное старение, снижение толерантности к заразным, в том числе условно-патогенным болезням.
Особую актуальность в ветеринарии на современном этапе приобретает проблема борьбы со злокачественными заболеваниями, особенно системы крови (гемобластозами — лейкозами, ретикулезами крупного рогатого скота). Организм большинства млекопитающих состоит из 1012—1013 генетически идентичных клеток, а частота их мутаций близка к 1 на 1 млн, т. е. в организме постоянно образуется около 10 млн изменившихся в генетическом отношении (аномальных) клеток. При этой частоте мутаций (10-6) вероятность ее в одном тысячеклсточном организме близка к 10-3 Таким образом, существует вероятность «генетической поломки», равная 1 из 1 тыс.: 999 особей из 1000 будут жить нормально а одна заболеет или погибнет, если иммунная система не справится со своей задачей. Такой формальный расчет показывает, насколько важны объективная качественная и количественная оценка функционального состояния иммунной системы, разработка методов ее тестирования, стимуляции, равно как и ингибиции (особенно при пересадке донорских органов и тканей).
Защита организма от экзогенных и эндогенных факторов, несущих в себе признаки генетической чужеродности генома, центральное звено которой — распознавание «своего» и «чужого», является сущностной функцией иммунитета.
Иммунологическую функцию в организме выполняет специальная система клеток, тканей и органов, центральным звеном которой являются лимфоциты. Вся иммунная система есть совокупность лимфоидных органов и скоплений лимфоидных клеток. Лимфоидная система представляет собой ее морфологический синоним и включает вилочковую железу (тимус), селезенку, лимфоузлы, пейеровы бляшки (групповые лимфатические фолликулы) и другие лимфоидные скопления, лимфоциты костного мозга и периферической крови. Общее число лимфоидных клеток в организме близко к 1012. Совместно с макрофагами они осуществляют основные формы иммунологического ответа, в том числе и прежде всего выработку антител и накопление сенсибилизированных лимфоцитов, распознающих и элиминирующих антигенные субстанции.
В связи с этим важно правильно понимать биологическую сущность иммунологической реактивности и неспецифических факторов защиты (резистентности). Основной задачей иммунологической реактивности является специфическая блокада, нейтрализация, разрушение или элиминация именно тех субстанций, которые стимулируют иммунный ответ. Неспецифического иммунного ответа, как и неспецифической иммунологической реактивности, не существует.
Вместе с тем сопротивляемость организма инфекциям зависит также от непроницаемости защитных барьеров (кожи, слизистых оболочек) для большинства микроорганизмов, их бактерицидности, рН в пищеварительных органах, ферментативной активности (лизоцим, пропердин и др.), экскреции некоторых микроорганизмов (вирусов через почки), активности и количества фагоцитов в крови и тканях, составляющих общую неспецифическую защиту организма, не могущих называться неспецифической иммунологической реактивностью как не несущих на себе специального реагирования. Кожа и слизистые оболочки непроницаемы независимо от наличия контаминации их микроорганизмами; бактерицидность их зависит от кислотности и химических превращений пе-роксида водорода и не зависит от микробного загрязнения. Эти и другие неспецифические факторы защиты не изменяются под воздействиями антигенов и, таким образом, не относятся к иммунологической реактивности, составляя сущность резистентности.
В настоящее время выделяется 6 типов специфических реакций, составляющих сущность иммунологической реактивности: 1) выработка антител; 2) гиперчувствительность немедленного типа; 3) гиперчувствительность замедленного типа; 4) иммунологическая толерантность; 5) иммунологическая память и 6) идиотипическое взаимодействие. Кроме того, своеобразное место занимают аллогенная ингибиция, инактивация несингенных стволовых клеток и противоопухолевая активность естественных киллеров. Эти феномены относятся к категории первичного распознавания «своего» и «чужого» — торможения размножения генетически чужеродных клеток.
Основные неспецифические факторы защиты и специфические формы реагирования, составляющие иммунную реактивность, по Р. В. Петрову следующие:
Антигены.Субстанции, несущие признаки генетической чужеродности, при введении которых в организме возникают специфические иммунные реакции, называются антигенами. Антигенность присуща белкам, многим полисахаридам, полипептидам, липополисахаридам, а также некоторым искусственным высокомолекулярным соединениям, несущим на себе специфический отпечаток чужеродное™ организму, причем их минимальная молекулярная масса должна быть более 10 000 Д.
Для антигенов свойственны: чужеродность; антигенность; иммуногенность и специфичность. Антигены, возникающие вследствие присоединения к белковой молекуле группы, обеспечивающей новую иммунологическую специфичность (антигенной детерминанты), называются конъюгированными.
Иммунологическая специфичность антигенов определяется аминокислотным составом и их последовательностью в первичной полипептидной цепи; их концевыми аминокислотами; поверхностными антигенными детерминантами, которые играют основную роль в иммунологической специфичности антигенов. Крупные белковые молекулы несут на себе по нескольку детерминант антигенности, определяя их антигенную «валентность». Липиды и стероиды неантигенны.
Выделяют несколько видов антигенной специфичности: 1) видовая специфичность, по которой особи одного вида животных отличаются от особей другого; 2) групповая специфичность обусловливает различия среди особей одного вида; 3) типоспецифич-ность, имеет отношение к дифференциации микробных видов (возбудители ботулизма, например по характеру своего токсина, делятся на типы А, В, С, Д и Е); 4) гетероспецифичность и гетероантигены — общие для животных разных видов антигенные комплексы или детерминанты (например, антиген Форсмана имеется в эритроцитах лошадей, овец, собак, кошек, кроликов, крыс, уток — генетически удаленных видов); 5) функциональная специфичность (белки, выполняющие разные функции, альбумины, глобулины иммунологически неидентичны); 6) стадия специфичности — понятие, возникшее в познании иммунологии эмбриогенеза (на разных стадиях эмбриогенеза в тканях появляются антигены, отсутствующие ранее, и их нет в тканях взрослого организма); 7) гаптеноспецифичность, обусловленная гаптенной группировкой.
Новую антигенную специфичность могут приобретать комплексы белков с некоторыми лекарственными веществами, выступающими в роли гаптенов (лекарственные аллергии). Особо выделяется также патологическая специфичность, например «ожоговые», «раковые», «лучевые» и другие антигены.
Антитела.Это белки класса иммуноглобулинов, синтез которых стимулируется в ответ на парентеральное введение антигена и способные специфически взаимодействовать с ним.
Известны 5 классов иммуноглобулинов: IgМ, IgG, IgА, IgЕ и IgD, суммарное содержание которых в сыворотке крови около 2,5 % (по сухому остатку), т. е. не более 1/3 общего белка сыворотки. Они вырабатываются лимфоидными клетками.
IgА способны выходить за пределы слизистых оболочек (в кишечник, дыхательные пути) и составляют «первую линию обороны» организма. Сыворотка иммунизированного животного, содержащая антитела, называется иммунной, или антисывороткой.
Специфическое взаимодействие антител с антигенами, против которых они возникают, проявляется в виде ряда следующих феноменов, которые могут наблюдаться в лабораторных условиях.
Агглютинация состоит в том, что бактерии, соматические клетки и другие корпускулярные антигены во взвеси под влиянием антител склеиваются между собой. Она наблюдается, например, если эритроциты барана ввести в сыворотку других животных. Склеивание микробов или эритроцитов в сыворотке животных других видов есть проявление прямой агглютинации.
В практике часто используют не прямую, а пассивную агглютинацию (при работе с растворимыми антигенами—альбуминами, полисахаридными антигенами и др.). При этом антиген предварительно присоединяется к корпускулярному носителю — таннированным эритроцитам, частицам латекса, окиси бария и др., добавление к которым антител приводит к их агглютинации. Эта реакция характеризуется высокой чувствительностью при малых титрах антител.
Преципитация проявляется укрупнением антигенных субстанций под воздействием антител и помутнением прозрачных сред в связи с агрегацией растворенных частиц. В зависимости от условий постановки и учета реакции антиген — антитело они получили различное наименование.
Реакция кольцевой преципитации возникает, когда на иммунную сыворотку в пробирке наслаивают прозрачный раствор антигена и на границе их соприкосновения через несколько минут или часов образуется опалесцирующее кольцо преципитации.
Иммунофлюоресценция проявляется в том, что когда к молекуле антител присоединяется флюоресцирующий краситель (изотио-ционат натрия), антигены, связанные с антителами, становятся видимыми в ультрафиолетовом свете.
Радиоиммунологический метод (конкуренции с радиоактивным антигеном) — один из самых современных, когда учет реакции антиген—антитело проводят с помощью радиоизотопных («меченых») антител или антигенов. Измерение радиоактивности преципитата дает возможность определить количество антител или антигена в пробах.
Иммуноферментный метод по точности не уступает радиоиммунологическому, но более прост в исполнении. На стенки полистироловых пробирок сорбированы антитела против конкретного антигена. В них вносят исследуемый материал, при наличии искомого антигена он соединяется с антителами. Субстрат сливают и в пробирку вносят антитела против этого же антигена, меченные ферментом (обычно пероксидазой хрена). Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и остаются на стенках пробирки. Затем содержимое пробирки заменяют на смесь хромогена ортофениленадиамина с субстратом для взятого фермента — пероксида водорода. Если искомый антиген был, фермент фиксируется на стенке пробирки и разложит пероксид водорода, а освободившийся кислород окрасит хромоген в желтый цвет.
Метод Уанъе основан на измерении оптической плотности сыворотки после добавления антигена (фотоколориметрически).
Феномен лизиса основан на способности некоторых антител растворять клетки, против которых они возникли. Эти антитела называются бактериолизинами (эритролизинами, гемолизинами). Эта реакция происходит без комплемента, который в разных количествах имеется в сыворотке морских свинок. Реакция сначала идет по типу агглютинации, затем к комплексу антиген—антитело присоединяется комплемент и происходит локальное растворение бактериальной оболочки, эритроцитов или других клеток.
Феномен цитотоксичности определяется антителами — цитотоксинами, лишающими клетки жизнеспособности. Живые клетки не прокрашиваются эозином или трипановым синим, а погибшие быстро воспринимают краситель (в течение 30с). Реакция протекает при наличии комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) основана на этом же свойстве комплемента связываться с комплексом антиген—антитело. Соединяясь с одним комплексом антиген — антитело, комплемент не может перейти в другой, вводимый в реагирующую систему после взаимодействия первого комплекса и добавленного комплемента. В качестве второго комплекса используют смесь эритроцитов барана с антителами против них.
Если первый комплекс является комплексом антиген—антитело, то свободного комплемента в реагирующей смеси не будет и гемолиз эритроцитов не возникает, а если антител в исследуемом субстрате нет, произойдет гемолиз эритроцитов. Реакция используется при изучении противотканевых антител и аутоантител, вирусных инфекций.
Феномен специфической задержки используют для сравнения двух изучаемых антигенов. Например, готовят иммунную сыворотку против мышиных эритроцитов и, чтобы узнать, нет ли в ней антител против эритроцитов крысы (родственного вида), сыворотку обрабатывают эритроцитами крысы. При снижении титра антител имеются родственные антигены, если титр их падает — антигены идентичны.
Реакция нейтрализации токсинов. Антитоксины (антитела против бактерийных токсинов, змеиного яда и некоторых других) против токсинов антигенной природы, соединяясь с ними, нейтрализуют их. Количество антитоксина в иммунной сыворотке определяется величиной минимальных смертельных доз (ЛД100), которые могут быть нейтрализованы определенным количеством сыворотки. При столбняке, например, для этого применяют стандартные антитоксические сыворотки.
Феномен опсонизации состоит в усилении фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов в отношении антигенов, против которых они получены. Так, активность фагоцитов относительно стафилококков усиливается после обработки лейкоцитов или их донора антистафилококковой сывороткой. Этот эффект связывался с наличием специальных антител—опсонинов, но оказалось, что это лишь проявление основной функции иммуноглобулинов давать специфический комплекс антиген—антитело.
Для определения антигенных компонентов сложных биологических жидкостей и тканевых экстрактов используют реакции преципитации в агаре в виде иммунодиффузии и иммуноэлект-рофореза. При работе с токсинами и другими растворимыми антигенами используют метод пассивной гемагглютинации, при определении гормонов в крови — радиоиммунологический метод и т. д.
Различные классы иммуноглобулинов по-разному реагируют с антигенами.
Специфичность иммунитета в большей степени определяется антителами. При многих инфекционных заболеваниях после выздоровления остается пожизненный иммунитет — состояние специфической невосприимчивости к конкретной болезни. Сыворотка такого животного, введенная другому животному, создает состояние специфической невосприимчивости к конкретным возбудителям и токсинам — пассивный иммунитет, продолжительность которого сохраняется около 2—4 нед.
Природа антител. Антитела при электрофорезе сыворотки мигрируют в электрическом поле в составе γ-глобулинов, поэтому после иммунизации их количество возрастает. Считается, что возможное количество видов антител в организме более 10 тыс. По Международной классификации совокупность антител, ранее называвшаяся γ-глобулинами, получила наименование иммуноглобулинов (Ig). Все пять классов иммуноглобулинов (IgМ, IgG, IgА, IgЕ и IgD) имеют разную молекулярную массу (от 15 000 до 900 000 Д) и различаются по антигенным свойствам, однако антитела определенной специфичности почти всегда представлены разными классами. Первыми после иммунизации появляются IgМ, затем IgG, позднее IgА с той же антительной специфичностью.
Основную массу иммуноглобулинов сыворотки составляют IgG — 70—80 %. На IgА приходится 10—15 %, на IgМ 5—10, а на IgЕ и IgD — только около 0,2 %.
Взаимодействие антиген—антитело возможно только в электролитной среде (0,85%-ной по NаС1), а рН должен быть близок к нейтральному. Взаимодействие антигена с антителом происходит в первые же секунды или минуты. Визуально оно проявляется в виде агглютинации, преципитации и лизиса (может развиваться через несколько часов).
Комплекс антиген—антитело способен к диссоциации с элюированием (выведением) антител, чем пользуются при получении высокоспецифичных антител против антигена или его детерминанты. Это происходит при изменении рН среды до 9—10 или 5— 3, повышении концентрации NаС1 до 15 % и температуры до 60 °С.
В соответствии с антигенными особенностями вышеуказанные классы иммуноглобулинов делят еще на субклассы. Так, тяжелых цепей иммуноглобулинов описано более 20 аллотипов и т. д.
Динамика накопления и исчезновения антител из крови после иммунизации зависит от того, первично или вторично происходит взаимодействие организма с антигеном. В соответствии с этим различают первичный и вторичный иммунные ответы.
Первые антитела появляются в крови через 3—4 сут после введения антигена. Вторичный иммунный ответ развивается не только после повторной иммунизации, проводимой через 2—4 нед после первой. Эта способность к усиленной реакции на антиген сохраняется много месяцев и лет как проявление иммунологической памяти.
Проблема создания методов культивирования лимфоидных иммунокомпетентных клеток, позволяющая инициировать иммунный ответ в виде выработки антител in vitro(в пробирке), нашла решение в разработке методики получения клеточных гибридов — гибридом от слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивированными в питательной среде клетками миеломных штаммов с помощью полиэтиленгликоля. При этом гибриды от лимфоцита получают способность синтезировать определенное антитело и способность выживать в среде с ГАТ (гемантителами), а от миеломного «партнера» — способность бесконечно размножаться in vitro. Накопленный гибридомный клон может быть размножен, и синтезируемые им моноклональные антитела могут быть получены в любом количестве.
Гибриды создаются не только на основе В-лимфоцитов, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т-лимфоцитов. Созданы культуры Т-гибридом, синтезирующие разные лимфокины.