Приложение к ЗАНЯТИЮ 9

Классификация цитопатического действия (ЦПД) вирусов в культуре ткани.

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (вирусы Коксаки, ЕСНО, полиовирусы).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация (вирусы гриппа, клещевого энцефалита и др.).

3. Гроздевидная дегенерация (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция (вирус герпеса).

5. Симпластообразование (обезьяньи вирусы, вирусы кори, осповакцины, RS-вирус).

Методы обнаружения вируса в культуре ткани

1. Цитопатический эффект.

2. Реакция гемадсорбции.

3. Метод цветных проб.

4. Метод бляшек.

5. Иммунофлуоресцентный метод.

6. Реакция связывания комплемента.

7. Реакция гемагглютинации.

8. Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.

9. Реакция преципитации в агаре.

Методы определения типа вирусов (идентификация, типирование вирусов)

Определение типа вирусов в вируссодержащем материале основа­но на реакции нейтрализации биологического действия вируса (РНБД) типоспецифическими сыворотками. Конечный результат реакции может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация ЦПД;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции;

3) цветная проба;

4) задержка (торможение) гемагглютинации;

5) свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифических флуоресци-рующих сывороток;

6) нейтрализация в опыте на животных.

Вопросы к итоговому контролю «Общая вирусология и генетика МО».

1. Чем вирусы отличаются от всех остальных живых организмов?

2. Что такое вирион, капсид, нуклеокапсид, тип симметрии, суперкапсид?

3. Критерии классификации вирусов.

4. Типы вирусных геномов.

5. Методы культивирования вирусов.

6. Заражение лабораторных животных. Правила, способы.

7. Заражение куриных эмбрионов. Правила, способы.

8. Культуры клеток (тканей). Определение, классификация, получение.

9. Признаки размножения вирусов в курином эмбрионе.

10. Методы обнаружения вируса в культуре клеток.

11. Цитопатический эффект, определение, классификация.

12. Методы типирования вирусов.

13. Сущность реакции гемадсорбции.

14. Сущность метода цветных проб.

15. Сущность метода бляшек.

16. Сущность реакции гемагглютинации для обнаружения вирусов.

17. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций.

18. Что такое вирусоскопический метод диагностики?

19. Что такое вирусологический метод диагностики?

20. Типы вирусных инфекций.

21. Особенности и механизмы противовирусного иммунитета.

22. Механизмы персистирования вирусов в организме.

23. Механизмы проникновения вируса в клетку.

24. Где в хозяйской клетке размножаются ДНК- и где РНК-содержащие вирусы?

25. Стадии взаимодействия вируса с клеткой.

26. Что такое вирогения?

27. Механизмы противовирусного действия интерферона.

28. Что такое протоонкоген и онкоген?

29. Формы обмена генетическим материалом у бактерий.

30. Что такое конъюгация, ее механизм.

31. Что такое трансдукция, ее механизмы?

32. Что такое плазмиды, их биологические особенности.

33. Основные классы плазмид.

34. Бактериофаги. Их химический состав и морфология.

35. Типы инфекций, вызываемых бактериофагом. Их особенности.

36. Какая разница между вирулентным и умеренным бактериофагом?

37. Что такое лизогения? Лизогенная конверсия?

38. Стадии взаимодействия Т-чётного фага с бактериальной клеткой.

39. Для чего используются фаги в медицинской практике?

40. Что такое фаготипирование?

З А Н Я Т И Е10

Дата ______________

Тема: Микрофлора окружающей среды и организма человека. Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМО). Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы (1 день).

План занятия:

1. Знакомство с микрофлорой человеческого тела: посев отпе­чатков пальцев, посев слизи из зева.

2. Разбор понятия «санитарно-показательные микроорганизмы», знакомство с их основными группами.

3. Санитарно-бактериологическое исследование воды питьевой:

а) определение ОМЧ (разбор схемы);

б) титрационный метод (разбор схемы);

в) метод мембранной фильтрации (разбор схемы).

4. Санитарно-бактериологическое исследование воздуха:

а) посев воздуха седиментационным методом Р. Коха;

б) аспирационный метод (разбор).

5. Санитарно-бактериологическое исследование почвы (разбор).

а) определение общего количества бактерий в почве;

б) определение бактерий группы кишечных палочек (бродильный (титрационный) метод, метод мембранных фильтров, прямой поверхностный посев на плотные питательные среды);

в) определение перфрингенс-титра (посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера, использование сред накопления для определения клостридий в почве);

г) определение нитрифицирующих бактерий.

Методические указания

1. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки МПА и среды Эндо.

При помощи стерильного ватного тампона взять материал со сли­зистой оболочки зева и произвести посев на простой и кровяной МПА.

2. Критерии для СПМО (разбор). Три группы СПМО.

3. Разбор нормируемых микробиологических показателей качества воды: общее микробное число (ОМЧ), общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ), коли-фаги.

а) Определение ОМЧ (разбор схемы).

Для определения ОМЧ воды чаще всего используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каж­дого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают на питательные среды. В пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, стерильной пипеткой вносят 1 см³ из заранее приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют (со стороны донышка, а не крышки!), чтобы исключить случайную замену их при падении, сдвиге и др.

Разведения выбирают с таким расчётом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Из каждой пробы засевают два разведения. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала (разведения) в чашку наливают расплавленного и остуженного до 45⁺ 5°С 10-12 см³ питательного агара (питательную среду), толщина слоя которого должна быть 4-5 мм. Расплавленную среду и посевной материал незамед­лительно тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10-15 мин для охлаждения и застывания среды, после чего посевы помещают в термостат и инкубируют при заданной температуре и экспозиции.

Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а при посеве нативного материала - от 1 до 300 колоний. Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2-5-кратным увеличением.

б) Определение ОКБ и ТКБ титрационным методом.

Метод основан на накоплении бактерий после посева определенных объемов воды в жидкие питательные среды, с последующим пересевом на дифференциальную плотную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор) засевают три объема по 100 см³. При исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ (повторный анализ) засевают соответственно 100, 10 и 1 см³ — по три объема каждой серии.

в) Определение ОКБ и ТКБ методом мембранных фильтров.

Метод основан на фильтровании определенных объемов воды через мембранные фильтры. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–С–1, МФАС–С–2, МФАС–МА (№ 4–6) или зарубежные — ISO 9000 или EN 29000). При исследовании воды неизвестного качества для получения изолированных колоний фильтруют следующие объёмы воды: 10, 40, 100 и 150 см³ соответственно на 4 фильтра. Далее фильтры помещают на чашки со средой Эндо и инкубируют при 37°С или 44°С в течение 24 ч. Если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост плёнчатых, губчатых, плесневых, прозрачных или расплывчатых колоний, то выдаётся отрицательный ответ.

4. Для санитарно-бактериологической оценки состояния воздуха используют седиментационный и аспирационный методы.

а) Седиментационный метод Коха прост, не требует специальной аппаратуры. Суть метода: чашка с питательной средой ставится на рабочем столе, открывается на 10 мин, закрывается и ставится в термостат, где выдерживается двое суток при температуре 37°С, а затем двое суток при комнатной температуре. После этого проводится подсчет выросших колоний по формуле Омелянского.

Для выявления грибов в воздухе посев проводится на среду Сабуро, и чашка выдерживается при 22-25°С до 5 суток. Для выявления патогенных бактерий посевы проводят на дифференциально-диагностические среды: для золотистого стафилококка — на желточно-солевой агар, для энтеробактерий — на среду Эндо с добавлением генцианвиолетта (для торможения роста сапрофитов), для псевдомонад — на среду № 9 (ГФ XI, т. 2). Чашки выдерживают в открытом виде 1 час, после чего ставят в термостат для культивирования при 37°С на двое суток с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение 2 суток.

Расчет по модифицированной формуле Омелянского ведется на 1 м² поверхности:

X = n^.10⁴ / p^.r^2.t ,

где X - ОМЧ воздуха обследуемого помещения (КОЕ); п - количество колоний на чашке (КОЕ); t - время экспозиции чашки (мин); p^.r^{2 -} площадь чашки Петри (см²); 10⁴ - пересчет м² в см².

Формула Омелянского, даже модифицированная, имеет ряд существенных недостатков: 1) нельзя определить точный объем воздуха, из которого микробы оседают на чашку; 2) мелкодисперсная фаза аэрозоля (а с ним и микробы) практически не оседает и токами воздуха постоянно поддерживается во взвешенном состоянии.

Результаты, получаемые с помощью этого метода, позволяют сравнить, сопоставить степень микробной обсемененности разных помещений и ориентироваться при разработке мероприятий по очищению воздушной среды.

б) Аспирационный метод изучения микрофлоры воздуха основан на использовании ударной струи воздуха, получаемый с помощью аппарата Кротова или других подобных ему аппаратов (импактеры (ПУ-1Б), импинджеры (ПОВ-1), система HiAir Petri^TM . Последняя позволяет пропускать до 1000 л воздуха за 200 сек.). Достоинства этого метода:

- точно учитывается объем воздуха, пропускаемого через чашку с питательной средой, установленную в аппарате;

- принцип ударной струи воздуха способствует фиксации на влажной поверхности питательной среде всех взвешенных частиц аэрозоля.

Таким образом, удается фиксировать на поверхности плотной питательной среды максимальное количество микроорганизмов, обитающих в воздухе. Используя различные виды элективных и дифференциально-диагностических питательных сред, можно выявлять в воздухе все основные группы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

5. Для санитарно-бактериологической оценки состояния почвы используют определение общего количества бактерий, бактерий группы кишечной палочки, а также определение перфрингенс-титра и нитрифицирующих бактерий.

а) При определении общего количества бактерий в почве посев проводят в 1,5% МПА – не менее двух различных разведений пробы в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение тщательно перемешивают стерильной пипеткой, забирают 1 см³ суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри. Из каждого разведения посев проводят минимум в две параллельные чашки. После этого в чашки вливают 15-20 см³ предварительно расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара, тщательно перемешивают с почвенной суспензией и оставляют до застывания в строго горизонтальном положении. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат в перевёрну­том виде (крышкой вниз) при температуре 37 °С на 24 ч. После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчёт на 1 г почвы.

б) Определение бактерий группы кишечных палочек проводят несколькими методами: бродильным (титрационным), методом мембранных фильтров и прямым поверхностным посевом в плотные питательные среды.

Бродильный (титрационный) метод. При анализе почвы с невысокой степенью фекального загрязнения рекомендуют проводить определение БГКП титрационным методом с использованием среды Кесслер или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). 10 см³ почвенной суспензии первого разведения (1:10) засевают во флакон с 50 см³ среды, что соответствует посеву 1 г почвы. Последующие разведения высевают по 1 см³ в пробирки с 9 см³ той же среды. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном добавляют 0,3 см³ 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон – по 1,5 мл. Методика посева с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восста­навливать бесцветное соединение ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в осадок, придающий среде коричнево-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микро­флоры подавляется. Посевы на среде Кесслер-Свенертона инкубируют 48 ч при температуре 43 или 37 °С. Отсутствие через 48 ч газообразования и помутнения в бродильных сосудах позволяет дать отрицательное заключение о наличии БГКП. Отрицательное заключение при использовании лактозного бульона с ТТХ дают через 24 ч в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился. При наличии признаков бактери­ального роста проводят высев на среду Эндо или розоловый агар. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. В случае отсутствия при­знаков роста на чашках дают отрицательное заключение. Красные, розовые с металлическим блеском, жёлтые и оранжевые колонии на розоловой среде типичны для кишечных палочек. На заключительном этапе исследования проводят идентификацию выросших на агаризованных средах характерных колоний (аналогично анализу БГКП в воде). Результаты анализа выражают коли-титром.

Метод мембранных фильтров используют в качестве ускоренного метода анализа слабозагрязнённых почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 с помощью фильтровального аппарата Зейтца пропускают 5–10 см³ почвенной суспензии первого разведения, которую предварительно центрифугируют при 2000 об./мин в течение 5 мин. Дальнейшее исследование проводят аналогично анализу БГКП в воде методом мембранных фильтров.

Прямой поверхностный посев на плотные питательные среды применяют для исследования почвы из мест интен­сивного фекального загрязнения. Проводят прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 см³ на среды Эндо. При анализе сравнительно чистых почв посев проводят из раз­ведений 1:10-1:100, для загрязнённых почв используют разведение 1:10⁶. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в тече­ние 24 ч. На следующем этапе исследования идентифицируют выде­ленные бактерии (аналогично определению БГКП в воде).

Результаты двух последних методов исследований выражают коли-титром или коли-индексом.

в) Определение перфрингенс-титра проводят по двум общепринятым методикам.

Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера. Из всех почвенных разведений (до 1:10⁶) образцы по 1 см³ перено­сят в 2 параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 °С в течение 15 мин и/или при 90 °С – 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 9-10 см³ свежеприготовленной среды Вильсона-Блера. Инкубацию посевов проводят при температуре 37 или 43 °С в течение 24 ч. Учёт можно проводить и несколько раньше, так как санитарно-показательные клостридии, преимущественно С. perfringens, через несколько часов образуют колонии чёрного цвета. Обнаружение в мазках колоний характерных грамположительных палочек указывает на наличие С. perfringens. Общепринятая методика определения С. perfringens на среде Вильсона-Блера имеет существенный недостаток – питательная среда в определённой степени ингибирует рост микроорганизма. Для устранения этого явления предложена модификация методики.

Использование сред накопления для определения клостридий в почве. По 1 см³ прогретых и нативных почвенных разведений засевают в пробирки с полужидкими и жидкими питательными средами, предварительно регенерированными кипячением (Клодницкого, Китт-Тароцци, бульона Мартена с ватой и др.). После инкубации посевов в течение 18-20 ч при температуре 37 °С проводят высев 0,5-1 см³ материала из помутневших пробирок в среду Вильсона-Блера или сульфит-полимиксин-неомициновую среду. Посев, инкубацию и учёт при этом проводят аналогично первому способу.

г) Для определения нитрифицирующих бактерий сеют почвенные разведения во флаконы с минеральной средой Виноградского, разлитой тонким слоем. В ходе эксперимента два флакона со средой оставляют незасеянными в качестве контроля чистоты среды. Посевы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14-15 сут. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде образуются азотистая и азотная кислоты, которые определяют на 5-7 сутки после посева и вторично – на 14-15. Титр нитрифицирующих бактерий определяют качественной реакцией с дифениламином, который в присутствии азотистой и азотной кислот даёт синее окрашивание. Пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносят на стеклянную или фарфоровую пластинку, добавляют несколько капель дефениламина, разведённого концентрированной серной кислоте. Синее окрашивание указывает на присутствие в среде продуктов метаболизма нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов должна оставаться без изменения окраски.

Контрольные вопросы

Какие микроорганизмы называют санитарно-показательными?

В чем сущность прямого метода санитарной оценки объектов внешней среды?

Какие существуют показатели-критерии косвенного метода индикации микроорганизмов внешней среды?

Что такое общее микробное число, и какие методы его определения вы знаете?

Какие микроорганизмы относятся к первой группе СПМО?

Какие бактерии называют колиформными?

Какие колонии образуют на среде Эндо типичные лактозоположительные бактерии?

Какие микроорганизмы относятся ко второй группе СПМО?

Что такое титр СПМО?

Что такое индекс СПМО?

Какие микробиологические показатели определяют при оценке качества питьевой воды централизованного водоснабжения?

Как определяют ОМЧ воды?

Что такое ОКБ и ТКБ?

В чем сущность метода мембранных фильтров при определении ОКБ и ТКБ воды?

Какие фильтры используют при исследовании воды?

Какие методы обнаружения микроорганизмов в воде вы знаете?

Как определяется ОКБ в почве?

Какие методы используются для определения БГКП в почве?

В чем сущность бродильного метода определения БГКП?

В каких случаях используется прямой поверхностный посев почвы на плотные питательные среды?

Что такое перфрингенс-титр, и какими методами он определяется?

Какие питательные среды используют для определения перфрингенс-титра?

Какие СПМО почвы вы знаете?

Какие показатели определяют при санитарном анализе почвы?

Какую роль в почве выполняют аммонификаторы и нитрификаторы?

Какие микробиологические показатели определяются при исследовании воздуха?

Что такое резидентная микрофлора воздуха?

Что такое транзиторная микрофлора воздуха?

Какие санитарно-показательные микроорганизмами при исследовании воздуха в закрытых помещениях вы знаете?

На каком принципе основан метод Коха при санитарно-микробиологическом исследовании воздуха?

Какие недостатки имеет метод Коха?

Как можно использовать результаты, полученные при исследовании воздуха методом Коха?

В чем сущность аспирационного метода изучения микрофлоры воздуха?

Какие приборы для отбора проб воздуха вы знаете?

Какие достоинства имеет аспирационный метод исследования воздуха?

Что такое общая бактериальная обсемененность воздуха?