Биохимические основы антибиотикорезистентности

Можно выделить следующие пять биохимических механизмов формирования резистентности:

1. Разрушение молекулы антибиотика. Такой механизм лежит главным образом в основе формирования устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Бета-лакта­мазы, разрушая структуру пенициллинов и цефалоспоринов, обеспечивают устойчи­вость к ним бактерий.

2. Модификация структуры молекулы антибиотика, в результате которой утрачи­вается ее биологическая активность. Гены, содержащиеся в R-плазмидах, кодируют белки, которые вызывают различные модификации молекул антибиотика путем их ацетилирования, фосфорилирования или аденилирования. Именно таким путем инактивируются аминогликозиды, макролиды, хлорамфеникол, клиндамицин и другие антибиотики. Существуют целые семейства генов, определяющих инактивацию того или иного антибиотика даже по одному из указанных выше механизмов. Например, среди клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий обнаружены различные изоферменты аминогликозидфосфо-, -ацетил- и -аденил-трансфераз, обеспечивающие устойчивость бактерий к различным спектрам ами-ногликозидных антибиотиков.

3. Изменение структуры чувствительных к действию антибиотиков мишеней. Из­менение структуры белков рибосом 70S лежит в основе устойчивости к стрептомици­ну, аминогликозидам, макролидам, тетрациклинам и другим антибиотикам. Измене­ние структуры бактериальных гираз в результате мутации приводит к формированию устойчивости к хинолонам; РНК-полимераз - к рифампицину; пенициллинсвязыва-ющих белков (транспептидаз) - к бета-лактамам и т. п.

4. Образование бактериями «обходного» пути метаболизма для биосинтеза бел­ка-мишени, который оказывается нечувствительным к данному химиопрепарату, - механизм, который лежит в основе резистентности к сульфаниламидным препаратам.

5. Формирование механизма активного выведения из клетки антибиотика, в ре­зультате чего он не успевает достичь своей мишени (один из вариантов устойчиво­сти к тетрациклинам).

З А Н Я Т И Е14

Дата ______________

Тема: Инфекционный процесс. Изучение факторов патогенности бактерий. Биологический метод диагностики.

План занятия:

1. Факторы патогенности. Экзотоксины.

а) Определение экзотоксина реакцией преципитации в геле. Демонстрация.

б) Мембраноповреждающие токсины (разрушают эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, мастоциты, клетки культур тканей, протопласты и др.). Определение повреждающего действия на эритроциты (гемотоксина).

в) Определение некротоксического действия мембраноповреждающего токсина с помощью внутрикожной пробы на лабораторных животных - дермонекротическая проба. Демонстрация.

2. Факторы патогенности. Эндотоксин. Определение эндотоксина пробой на кролике. Демонстрация.

3. Факторы патогенности. Ферменты.

а) Гиалуронидаза. Определение гиалуронидазы - фактора проник­новения в опыте на кролике. Демонстрация.

б) Фибринолизин. Определение фибринолизина на средах с плазмой крови. Разбор методики.

в) Плазмокоагулаза. Определение плазмокоагулазы, демонстрация опыта.

г) Лецитиназа. Определение лецитиназы на желточных средах. Де­монстрация.

4. Методы заражения экспериментальных животных. Заражение бе­лой мыши.

Методические указания

1. а) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.

Полоска фильтровальной бумаги размером 1,5x8 см, простерилизованная в автоклаве, пропитывается антитоксической противодифтерий­ной сывороткой "Диаферм-3", разведенной физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в I мл.

Смоченную сывороткой бумагу стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 20 минут. Испытуемые культуры (колонии) засевают петлей бляшками диаметром в I см на расстоянии 0,5 см от бумаги. На одну чашку засевают несколько штаммов, в том числе один заведомо токсигенный. Рекомендуется каждую культуру засевать не менее чем четырьмя бляшками (по две с каждой стороны от бумаги). Посевы помещают в термостат. Учет производят через 24, 48, 72 часа. Определение токсигенности основано на следующем принципе: образующийся в процессе роста дифтерийных бактерий экзотоксин диффундирует в питательную среду. Одновременно в среду диффундирует специфическая антитоксическая противодифтерийная сыворотка. В тех местах среды, где токсин и антитоксин встречаются в оптимальных соотношениях, выпадает реакция преципитации в виде белой изогнутой линии. Исследуемые бактерии считаются токсигенными, если линии преципитата их сливаются с линиями преципитата контрольного штамма. Демонстрация опыта по определению токсина методом преципитации в агаре.

б) Для определения гемотоксина произвести посев золотистого,
стафилококка на пластинки кровяного МПА. Для этого чашка с кровяным
МПА делится на два сектора. На одном из них засевается культура золотистого стафилококка, а на другом - для контроля - культура нетоксигенного белого стафилококка.

в) Определение некротоксина производится путем внутрикожного
введения лабораторному животному 0,2 мл бульонной культуры (или
фильтрата бульонной культуры) испытуемого микроба.

Через сутки или двое суток на месте введения образуется очаг некроза. Демонстрация опыта. Зарисовать дермонекротическую пробу.

2. Демонстрация опыта по выявлению брюшнотифозного эндотоксина внутрикожной пробы на кролике. 0,2 мл эндотоксина, полученного путем обработки культуры трихлоруксусной кислотой, вводят внутрикожно кролику. На месте введения эндотоксина через 24-48 часов отмечается воспалительная реакция. Зарисовать.

3. а) Для выявления гиалуронидазы кролику в один участок депилированной кожи вводят внутрикожно 0,2 мл туши в физиологическом растворе, а в такой же соседний участок - 0,2 мл туши с прибавлением фильтрата бульонной культуры стафилококка.

Пятно на месте инъекции туши с фильтратом бульонной культуры стафилококка через 24-48 часов в несколько раз превосходит по размерам пятно на месте введения туши без фильтрата за счет повышения проницаемости ткани в присутствии гиалуронидазы. Демонстрация опыта.

б) Для выявления фибринолитического фермента в чашки Петри с
агаровой средой, содержащей плазму, засевают испытуемую культуру.
После инкубации в течение 24-48 часов при 37 °C образуется зона просветления вокруг колоний бактерий, продуцирующих фибринолизин. Де­монстрация опыта.

в) Для выявления фермента плазмокоагулазы испытуемую культуру засевают в 0,2 мл цитратной кроличьей или человеческой плазмы. В случае выработки плазмокоагулазы через 2-4-6-18 часов инкубации при 37 °C происходит свертывание плазмы. В контроле плазма остается жидкой. Демонстрация опыта.

г) Для выявления лецитиназы изучаемую культуру засевают на желточный агар. При наличии лецитиназы вокруг колонии бактерий образу­ется зона помутнения и радужного венчика. Демонстрация опыта.

4. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:

а) подкожный способ заражения кролика и белой мыши;

б) внутрикожный способ заражения кролика и морской свинки; в)накожный способ заражения морской свинки;

г) внутривенный способ заражения кролика и белой мыши;

д) внутрибрюшинный способ заражения морской свинки и белой мыши.

Промикроскопироватъ культуру палочки Фридлендера с косячка МПА, окрасить препарат по Граму (по Ионэ), проверить чистоту культуры. Если культура чистая, приготовить из нее взвесь. Для этого стерильной пипеткой добавить в пробирку с культурой 5 мл стерильного физиологического раствора и вращением пробирки между ладонями рук смыть культуру; 0,2 мл полученной взвеси ввести внутрибрюшинно бе­лой мыши. Зараженное животное маркировать краской и поместить в специальную банку.

Окраска капсул по Ионэ. На приготовленный и зафиксированный в жидком фиксаторе мазок наливаю 2%-ный раствор генцианвиолета и окрашивают в течение 3-х минут при легком подогревании над пламе­нем горелки. Затем сливают краску и наносят на препарат I %-ный раствор уксусной кислоты на 10 секунд (стекло необходимо покачивать). Препарат промывают водой, сушат и микроскопируют под иммерсией. Тела бактериальных клеток и фон окрашивается в фиолетовый цвет, капсулы не окрашиваются. Препарат зарисовать.

Определение экзотоксина реакцией преципитации в агаре	Палочка Фридлендера Klebsiella pneumoniae Окраска____________

Контрольные вопросы

Что такое экзотоксин?

Что такое эндотоксин?

Каковы основные свойства экзотоксинов?

Каковы основные свойства эндотоксинов?

Какова химическая природа экзо- и эндотоксинов?

Что произойдет с экзотоксином, если его обработать формалином? Какие методы используются для обнаружения экзотоксинов?

Как называются бактерии, способные образовывать экзотоксин? Каков механизм действия гемотоксина, как можно обнаружить его присутствие?

На чем основан метод определения токсина в геле (агаре)?

Какие методы используются для обнаружения эндотоксинов?

Как определяется сила действия экзотоксина? Что такое минимальная смертельная доза, DL50?

Какие факторы патогенности (кроме токсинов) вы знаете?

Что такое патогенность и вирулентность микробов? Какие ферменты могут играть роль факторов патогенности? Какой фермент содержится в факторе распространения? Его действие на соединительную ткань?

С какой целью производится заражение лабораторных животных? Какие способы заражения животных Вы знаете?

Как маркируются подопытные животные и как они содержатся?

Какие меры предосторожности следует соблюдать при заражении животных?

Как производится подготовка животных к опыту?

Как осуществляется наблюдение за подопытными животными?