Электронная микроскопия

Устройство электронного микроскопа.

Возможности световых микроскопов ограничены волновой природой света. При оптимальных условиях световые микроскопы позволяют наблюдать, вследствие явления дифракции, объекты размером не менее 1/2 - 1/3 длины световой волны (около 0,2μ ).

Наибольшими возможностями в смысле разрешающей способности обладают электронные микроскопы, в которых пучок света заменен пучком электронов, длина волны которых составляет 0,04-0,05А.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового микроскопа, в котором все оптические элементы заменены соответствующими электрическими: источник света заменен источником электронов, стеклянные линзы - линзами электромагнитными, В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, электропитания,

Электронно-оптическая система снабжена двумя конденсорными, объективной, промежуточной и проекционной линзами, обеспечивающими увеличение электронного микроскопа от 300 до 200000 крат. Промежуточная и проекционная линзы обеспечивают плавное изменение увеличения при постоянном поле изображения.

Фотографирование изображений при всех видах исследований производится на фотопластинки, фотопленку или фотобумагу.

В комплект электропитания электронного микроскопа входят: шкаф питающего устройства, выпрямитель высоковольтный, пульт управления, щит распределительный, трансформатор высокочастотный, стабилизатор феррорезонансный, соединительные кабели. Устройство обеспечивает электрическое питание всех узлов электронного микроскопа от сети трехфазного переменного тока с напряжением 220 или 380В, частотой 50 гц.

Вакуумная система электронного микроскопа позволяет получать и поддерживать в процессе работы рабочий вакуум 2·10^-4 мм рт.ст. в колонне микроскопа, производить шлюзование камеры объекта и фотокамеры. Герметичность вакуумной системы и колонны микроскопа в местах их соединения обеспечивается применением резиновых уплотнителей. Вакуумная система состоит из следующих основных узлов: стояка, вакуумного реле, высоковакуумного клапана, клапана распределительного, комбинированной ловушки, камеры вакуумной, обходного клапана, ловушки предварительного разрежения, диффузионного насоса, вспомогательного диффузионного насоса, баллона предварительного разрежения, механического насоса.

Источником пуска электронов является электронная пушка, состоящая из V -образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900° в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его различной толщины и плотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличенное изображение объекта. После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения диффракции с участков исследуемых образцов. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объектов, которое направляется на флуоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с веществом люминофора Флуоресцирующего экрана на нем возникает видимое изображение объекта. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Методы электронно-микроскопического препарирования.

а) Приготовление пленок-подложек и их монтаж на предметные сетки

Электронномикроскопическому изучению могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные структуры, выделенные при разрушении клеток различными способами.

Для того, чтобы исследовать различные объекты в световом микроскопе, их помещают на предметное стекло. При электронномикроскопических исследованиях роль предметного стекла (оно не может быть использовано, так как непроницаемо для электронов) выполняют очень тонкие, прозрачные пленки-подложки, которые крепятся на опорные сетки.

Обычно для исследований применяют сетки, приготовленные из платины или чистой меди и имеющие до 100 ячеек на I мм². Они могут быть плетеными или изготавливаются специальным фотохимическим способом. Выпускаются как в готовом виде с внешним диаметром 2 или 3 мм. так и в виде полотна, из которого вырубаются специальными пробойниками.

Толщина пленок-подложек должна быть не более 200А, так как более толстые пленки увеличивают угловое рассеивание электронов, отчего контрастность изображения и разрешение структур объектов значительно уменьшаются. Чаще всего для электронномикроскопи-ческих исследований биологических объектов применяют коллодиевые, формваровые и угольные пленки-подложки.

Благодаря своему заряду электроны слабо проникают через плотные среды. Поэтому объект для исследования должен быть максимально проницаемым для электронов. По этим же соображениям подложка должна быть электрононейтральной, чтобы не задерживать электронов, и бесструктурной, чтобы не затемнять структуру объекта. Кроме того, подложки должны быть прочными, чтобы выдерживать высокую температуру. Для получения пленок-подложек из нитроцеллюлозы пользуются 1,5-2%-ными растворами коллодия в амилацетате (чистый коллодий получают путем выпаривания аптечного эфирного раствора коллодия). Каплю раствора коллодия наносят на поверхность дистиллированной воды, налитую в чашку диаметром около 20 см. Капля быстро растекается по поверхности воды, и после испарения амилацетата образуется тонкая пленка.

Пленки из формвара (поливинилформальдегида) несколько прочнее, чем из коллодия, но получать их сложнее, так как растворители формвара - диоксан, дихлорэтан - не растекаются по поверхности воды, как амилацетат, и, кроме того, очень токсичны. Для получения формваровых пленок чистое, хорошо отшлифованное стекло опускают в раствор 0,1-0,2%-ного формвара в диоксане или дихлорэтане, затем вынимают и подсушивают 5-10 минут на воздухе. На стекле образуется тонкая пленка, которую обрезают по краям стекла, стекло опускают под углом 45° в чашку с водой, пленку осторожно снимают на поверхность воды.

В последнее время все чаще применяют углеродные пленки (они химически инертны, хорошо переносят электронную бомбардировку, термостойки), которые получают путем испарения углерода в вакуумной установке. В установку помещают чистое шлифованное стекло и при контакте двух графитовых стержней, на которые подается электрический ток, на стекло распыляют углерод. Затем тонкую пленку, полученную на поверхности стекла, снимают на поверхность воды, как и в случае снятия формваровой пленки.

После того как на поверхности воды образуется тонкая пленка, полученная одним из вышеописанных способов, на пленку аккуратно пинцетом наносят опорные сетки выпуклой стороной вниз. После этого поверх сеток накладывают листок фильтровальной бумаги и снимают его вместе с пленкой о поверхности воды. Сетки оказываются заключенными между пленкой и фильтровальной бумагой. Бумагу подсушивают, и сетки вместе с подложкой снимают осторожно пинцетом для размещения на них объектов, подлежащих микроскопическому исследованию.

б) Методы негативного и позитивного контрастирования

При рассмотрении объекта в электронном микроскопе и выявлении тонких деталей его строения важны два основных фактора: разрешающая способность микроскопа и контрастность объекта. Ряд биологических структур рассеивают электроны почти так же, как и пленка-подложка, в результате чего контрастность настолько мала, что даже при достаточной разрешающей способности микроскопа изображение объекта не будет различимо. Для увеличения контрастности применяют ряд методов.

Негативное контрастирование. В основе этого метода лежит принцип разности контрастов. При этом исследуемый объект смешивают с раствором соли тяжелого металла и наносят на сетку. Контрастирующее вещество окружает объект более низкой плотности, в результате чего малоконтрастный объект становится отчетливо различим на окружающем его темном фоне. В этом случае получают негативный эффект. Для негативного контрастирования применяют 2%-ный раствор уранилацетата или 2%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты.

Позитивное контрастирование. Известно, что соли тяжелых металлов могут специфически реагировать с различными биологическими веществами, тем самым они могут повышать контрастность соответствующих структур. Например, осмий хорошо реагирует с липоидными веществами, уранилацетат - с нуклеиновыми кислотами, соли свинца с белковыми компонентами клеток и тканей. Увеличение контрастности структур, возникающее после взаимодействия их с солями тяжелых металлов, обеспечивает позитивное контрастирование объекта, так как в результате "окраски" структуры становятся менее проницаемыми для электронов и выглядят темными на светлом фоне препарата.

в) Метод оттенения

Для увеличения контрастности исследуемых объектов применяют также метод оттенения. При изготовлении образцов по этому методу исследуемый объект помещают в вакуумную напылительную установку и на него под определенными углами производят испарение металла (платины, палладия, золота, хрома, углерода) или их сплавов.

В тех местах, где объект будет экранировать пучок частиц, возникают тени. Рассеивание и поглощение электронов для различных участков объекта оказывается различным, в результате чего контрастность изображения возрастает. Этот метод позволяет не только увеличить контрастность, но и установить в ряде случаев размеры исследуемых объектов по длине тени и углу отклонения с использованием специальных формул.

Методы получения ультратонких срезов

а) Способы фиксации и заливки биологических объектов

Основная цель фиксации - сохранить объект в таком состоянии, которое правильно бы отражало прижизненное состояние объекта. "В настоящее время в практике электронной микроскопии применяют химические способы фиксации. По способу действия на живые структуры все химические фиксаторы разделяют на две группы:

1) фиксаторы, осаждающие (коагулирующие) белки - спирты, уксусная и пикриновая кислоты, соли тяжелых металлов, которые в основном применяют в световой микроскопии;

2) фиксаторы, стабилизирующие липиды - четырехокись осмия, формалин, перманганат калия.

Для фиксации клеток из культур микроорганизмом, выращенных на плотных и жидких средах, применяют 1%-ный раствор KMnO4 приготовленный на ацетат-вероналовом буфере. При фиксации бактериальных клеток по Ритер-Келленбергер применяют стандартный раствор: 1% OsO₄ в ацетат-вероналовом буфере (рН=6,0), в котором фиксатором является осмий.

После фиксации производят обезвоживание. В качестве обезвоживающих веществ используют этиловый спирт, метиловый спирт и ацетон, которые берут в возрастающих концентрациях (30°, 50°, 70° , 96°, 100°).

После обезвоживания объекты заключают в пластмассы или другие среды. Так как оптимальная толщина срезов должна быть не более 250-800 А, то необходимо, чтобы заливочный материал обладал определенной твердостью и другими свойствами. Для этих целей используют пластические массы - метакрилаты, эпоксидные смолы.

В практике электронной микроскопии чаще используют метакрилаты: бутилметакрилат и метилметакрилат. Бутилметакрилат полимеризуется в сравнительно мягкие блоки, поэтому к нему прибавляют 10-20% метилметакрилата. В качестве катализатора применяют 1-2%-ную перекись бензоила. Заливочную смесь (рабочую) заливают в желатиновые капсулы, где происходит полимеризация ее при 600 в течение 48 часов.

б) Приготовление стеклянных ножей

Одним из самых важных этапов при получении ультра тонких срезов является процесс приготовления стеклянного ножа. Стеклянные ножи готовят из полос специального (зеркального) стекла, толщина которого должна быть 5 мм. Из такой полосы приготавливают квадраты размером 3x3 см, для чего стеклорезом вначале делают нарезки и по нарезу обламывают клетки-квадраты. Затем приготовленный квадрат надрезают по диагонали и разламывают.

Насечки стеклорезом производят таким образом, чтобы они не доходили до края стекла на 2-3 мм. После разламывания квадрата по диагонали с помощью лупы просматривают получившиеся лезвия. Обычно нож получается несколько неровным и только небольшая его , часть имеет ровный участок, который и используется в качестве лезвия.

Выпускаются специальные приборы - станки для изготовления стеклянных ножей (напр., ССН-1), которые значительно облегчили процесс изготовления ножей. После изготовления ножа на нем укрепляют ванночку из лейкопластыря, и нож с ванночкой устанавливают в микротом.

Демонстрация приготовления стеклянных ножей с помощью прибора ССН-1.

в) Ознакомление с устройством ультрамикротома и получением ультратонких срезов

Незначительная проникающая способность электронов даже при больших ускоряющих -напряжениях требует изготовления сверхтонких срезов. Ультратонкие срезы получают на специальных приборах, называемых ультрамикротомами. В современных микротомах применяется тепловая подача металлического стержня, а через него и блока (объекта) по отношению к ножу. Для подготовки препарата к резанию необходимо, чтобы полушаровидныи конец цилиндрического блока был заточен в виде пирамидки, содержащей объект. Все операции по заточке блока производят под бинокулярной лупой. После подготовки блока к резке его устанавливают в микротом таким образом, что после включения последнего блок начинает двигаться по отношению к неподвижно закрепленному ножу. Получающиеся при микротомии ультратонкие срезы остаются в ванночке ножа, которая предварительно заполняется дистиллированной водой. Срезы свободно плавают на поверхности жидкости. Когда срезов накапливается достаточное количество, их собирают на сетке (прикосновением к поверхности жидкости).

Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.

З А Н Я Т И Е2

Дата ______________

Тема: Морфология и ультраструктура бактерий, риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицетов, спирохет, грибов, простейших. Классификация микробов.

План занятия:

1. Спирохеты возвратного тифа. Микроскопия готовых препаратов.

2. Бледная спирохета. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из чистой культуры бледной спирохеты или из исследуемого материала – отделяемого твёрдого шанкра.

3. Лептоспиры. Демонстрация препарата из исследуемого материала с импрегнацией серебром.

4. Актиномицеты: а) микроскопия препарата-мазка из чистой культуры актиномицета; б) демонстрация готового препарата друзы актиномицета.

5. Нитчатые (плесневые) грибы. Макроскопия культур и микроскопия препаратов "раздавленная капля".

6. Дрожжевые грибы. Микроскопия окрашенных препаратов-мазков.

7. Дрожжеподобные грибы рода кандида. Микроскопия культур грибов кандида.

8. Простейшие:

а) микроскопия трипаносом, окрашенных по Романовскому;

б) микроскопия препаратов лейшманий из тканей больного и из чистой культуры.

9. Малярийный плазмодий. Микроскопия препаратов из крови больных малярией: изучение стадий развития плазмодия малярии.

10. Токсоплазмы. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из органов зараженной токсоплазмами белой мыши.

11. Амебы. Микроскопия готовых препаратов-мазков из испражнений больного амёбиазом.

12. Риккетсии. Разбор морфологии по таблицам.

13. Хламидии. Разбор морфологии по таблицам.

14. Микоплазмы. Разбор морфологии по таблицам.

Методические указания

1. Боррелии возвратного тифа в мазке крови больного при окраске по Романовскому-Гимзе на фоне форменных элементов крови выглядят как извилистые фиолетово-сиреневые нити, образующие от 3 до 8 завитков спирали. Завитки неравномерные, глубокие, шаги между завитками разные.

2. Бледная трепонема – возбудитель сифилиса – имеет вид спирали, напоминающей слегка растянутую пружину, имеющую от 6 до 14 завитков. Амплитуда завитков средняя, равномерная, шаг между завитками одинаковый. На концах пружина растянута, как бы, сильнее. При окраске по Романовскому-Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет.

3. Лептоспиры имеют вид тонкой сильной закрученной пружины, имеют 14-22 витка спирали. Концы часто загнуты в виде крючков (завитки второго порядка), что может им придавать С- или S-образную форму.

4. При микроскопии окрашенных мазков из чистой культуры обратить внимание на сплетение тонких нитей (гифов) и их истинное ветвление. Переплетение гифов – мицелий.

В гистологическом срезе из органа при актиномикозе центральная часть друзы актиномицета представляет сплетение тонких нитей, окрашенных в темно-фиолетовый цвет. Отходящие на периферию концевые нити образуют колбовидные вздутия, окрашенные в розовый цвет.

5. В каплю вода на предметном стекле вносят небольшую частицу гриба и накрывают покровным стеклом. При микроскопии со слабой и сильной сухими системами обратить внимание на строение мицелия и органов плодоношения. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла - многоклеточный. Органы плодоношения: большой спорангиеносец с эндоспорами у мукора; конидиеносцы несептированные в виде лейки у аспергилла, септированные в виде кисти рук у пеницилла.

6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.

7. Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 мкм. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная.

Наружных спор типа конидий и внутренних типа аскоспор дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды рода Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10-20 мкм, форма округлая, оболочка толстая, двуконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.

Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называются псевдомицелием и отличаются от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования.

8. Патогенные простейшие – жгутиконосцы.

8.1. Трипаносомы являются патогенными простейшими, относящимися к типу Sarcomastigophora, имеющими очень характерную морфологию. В мазке крови больного африканской сонной болезнью при окраске по Романовскому-Гимзе имеют размеры 15-30 мкм в длину и 1,4-3,0 мкм в ширину, длина жгутика колеблется от 12 до 42 мкм. Удлиненно-овальное ядро лежит почти в середине клетки, на заднем конце располагается блефаропласт, от которого отходит жгутик. Последний волнообразно изогнут, между ним и телом трипаносомы натянута прозрачная ундулирующая мембрана. От противоположного конца клетки жгутик продолжается на некотором расстоянии свободно.

8.2. Лейшманиальная форма (амастигота, тканевая форма) обнаруживается в патологическом материале в свободных макрофагах или клетках системы мононуклеарных фагоцитов. Амастиготы представляют собой мелкие овальные клетки размером 1-3 × 2-6 мкм с расположенным сбоку овальным ядром и хорошо видимым палочковидной формы кинето-пластом. В просвете кишечника переносчика-москита и в культуре на питательной среде безжгутиковые формы превращаются в подвижные жгутиковые промастиготы (лептомонадная форма). Они имеют веретенообразную вытянутую форму, размеры 4-6 × 10-20 мкм и жгутик, отходящий от кинетопласта. При окраске по Романовскому-Гимзе цитоплазма амастиготы и промастиготы окрашивается в голубой или голубовато-фиолетовый цвет, а ядро, кинетопласт и жгутик – в красный или красно-фиолетовый цвет.

9. В препаратах из крови больных трехдневной малярией найти различные стадии развития малярийного плазмодия: молодые шизонты кольцевидной формы с вакуолью в центре; зрелые шизонты неправильной амебовидной формы без вакуоли; делящиеся шизонты - в стадии меруляции; макфо- и микрогаметоциты правильной овальной формы. Обратить внимание на форму и размеры эритроцитов.

10. Токсоплазмы имеют форму полумесяца или напоминают дольки апельсина. Один конец токсоплазмы заострен, а другой - закруглен. Размеры их следующие: длина 4-7 микронов, ширина – 2-4 мкм. При окраске по методу Романовского-Гимзе цитоплазма токсоплазм окрашивается в голубой цвет; ядро, имеющее вид скопления гранул и сети, - в рубиново-красный цвет. Ядро располагается, как правило, в центре паразита, занимая около 1/4 части его тела.

11. Основной диагностический признак амёбиаза – обнаружение в испражнениях больного цист. Цисты правильной шаровидной формы, иногда слегка вытянуты, диаметр 8-15 мкм. Хорошо заметна бесцветная оболочка. Зрелые цисты содержат 4 ядра, незрелые цисты имеют одно, два, три ядра и вакуоль, содержащую гликоген. В свежем препарате ядра едва заметны; они хорошо выявляются при обработке препарата раствором Люголя.

12. Риккетсии – грамотрицательные прокариоты, не растущие на питательных средах, имеют мелкие размеры, форму палочек, кокковидную, иногда нитевидную. Жизненный цикл риккетсии зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из 2 стадий — вегетативной и покоящейся. Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии, имеют палочковидную форму, активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью. Риккетсии покоящейся стадии имеют сферическую форму и не размножаются. Обнаруживаются внутриклеточно окраской по Здродовскому.

13. Хламидии – грамотрицательные прокариоты, облигатные внутриклеточные «энергетические» паразиты. Основные стадии жизненного цикла:

1)элементарные тельца – мелкие (0,2-0,5 мкм) электронно-плотные шаровидные структуры, имеющие компактный нуклеоид и ригидную трехслойную клеточную стенку;

2)инициальные (исходные), или ретикулярные, тельца – большие (0,8-1,5 мкм в диаметре) сферические образования, имеющие сетчатую структуру с тонкой клеточной стенкой и фибриллярным нуклеоидом;

3)промежуточные тельца — промежуточная стадия между элементарными и ретикулярными тельцами.

Вегетативные формы размножаются путем бинарного деления внутриклеточно, но не инфекционны, когда выделяются из клетки-хозяина. Для микроскопического обнаружения хламидии в инфицированных клетках (тканях) применяют различные способы окрашивания: Романовского-Гимзы, Кастенады, Маккиавелло и др. При окрашивании по Романовскому-Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Однако хламидии хорошо видны и в неокрашенном состоянии при фазовоконтрастной микроскопии влажных препаратов под стеклом.

14. Микоплазмы – мелкие грамотрицательные прокариоты, лишённые клеточной стенки. Морфология их различна – шаровидные, вакуолизированные, нитевидные (нередко ветвящиеся), гранулярные (элементарные тельца) структуры. Обычно неподвижные, но некоторые виды обладают скользящей подвижностью.


Боррелии возвратного тифа Borrelia recurrentis	Бледная трепонема Treponema pallidum	Лептоспира Leptospira interrogans

Актиномицет Actinomyces	Друза актиномицета	Нитчатый гриб мукор Mucor

Нитчатый гриб аспергилл Aspergillus	Нитчатый гриб пеницилл Penicillium	Дрожжи Saccharomyces cerevisiae

Грибы кандида Candida albicans	Трипаносома Trypanosoma gambiense	Токсоплазма Toxoplasma gondii

Лейшмании в чист. кул-ре Leishmania tropica	Лейшмании в тканях Leishmania tropica	Патогенная амёба Entamoeba histolytica

Молодой шизонт при
3-дневной малярии Plasmodium vivax	4-дневной малярии Plasmodium malariae	тропической малярии Plasmodium falciparum

Зрелый шизонт при
3-дневной малярии Plasmodium vivax	4-дневной малярии Plasmodium malariae	тропической малярии (не обнаруживается !) Plasmodium falciparum

Стадия меруляции при
3-дневной малярии Plasmodium vivax	4-дневной малярии Plasmodium malariae	тропической малярии Plasmodium falciparum

Гаметоциты при
3-дневной малярии Plasmodium vivax	4-дневной малярии Plasmodium malariae	тропической малярии Plasmodium falciparum