Реакция нейтрализации (рн)

Цель занятия. Ознакомить студентов с реакцией нейтрализа­ции (РН). Освоить технику постановки РН для обнаружения и идентификации бактериальных токсинов.

Оборудование и материалы. Бульонные токсинсодержащие культуры С. perfringens, центрифуга, центрифужные пробирки, стерильные бактериологические пробирки, стерильный физио­логический раствор, воронки, ватно-марлевые фильтры, стери­лизатор со шприцами и инъекционными иглами, диагностичес­кие антитоксические сыворотки С. perfringens, белые мыши мас­сой 16...18 г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Реакцию нейтрализации относят к иммунологическим реак­циям, в которых, например, учитывают потерю биологической активности антигена при взаимодействии с гомологичными ан­тителами. Если антигеном служит бактериальный экзотоксин, то он теряет свои токсические свойства (нейтрализуется), вирус как антиген теряет в этом случае инфекционное действие и т. д.

В бактериологических диагностических исследованиях наибо­лее часто используют РН как метод обнаружения и идентифика­ции бактериальных токсинов.

РН бактериального экзотоксина.Используют при диагностике таких бактериозов, как ботулизм, инфекционная энтеротоксемия овец и др., возбудители которых (С. botulinum, С.perfringens) синте­зируют сильный экзотоксин. Для постановки диагноза на эти бак­териальные инфекции достаточно обнаружить экзотоксин в РН. Рассмотрим технику постановки РН на примере обнаружения токсинов С. perfringens. Для постановки РН необходимы диагнос­тические иммунные сыворотки, содержащие антитела к опреде­ленному бактериальному токсину, — антитоксические сыворотки, Такие диагностические сыворотки получают путем гипериммунизации животных-продуцентов анатоксинами, токсинами инактивированными (формальдегидом), но сохранившими свои иммуногенные свойства. С. perfringens продуцирует шесть типов экзоток­синов, различающихся по антигенной структуре (А, В, С, D, Е, F).

Исследуемый материал, в котором предположительно нахо­дится токсин (содержимое кишечника), разводят физиологичес­ким раствором в соотношении 1:1, экстрагируют при комнатной температуре 1 ч, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и цен­трифугируют при 5000 мин^-1 20 мин. Надосадочную жидкость вводят внутрибрюшинно или внутривенно по 0,5 мл двум белым мышам массой 16... 18 г. При наличии токсина в исследуемом ма­териале животные погибают в течение 12 ч. После обнаружения токсина его идентифицируют в реакции нейтрализации.

Схема постановки РН на примере определения типа токсина С. perfringens показана в таблице 14. Диагностические антитокси­ческие сыворотки (типов А, С, D, Е) предварительно разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 10 ед/мл.

Содержимое каждой пробирки после инкубирования вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 0,5 мл двум белым мы­шам. Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч. Если ток­син принадлежит С. perfringens, то мыши, получившие смесь ток­сина с гомологичной антитоксической сывороткой, остаются живы (табл. 15).

Другие варианты РН. При помощи нейтрализации антителами гемолизинов, продуцируемых различными штаммами бактерий одного вида, можно подтвердить антигенную однородность ге­молизина или доказать, что данный вид бактерий синтезирует несколько антигенных вариантов гемолизина.

В вирусологических исследованиях широко используют реак­цию нейтрализации инфекционного действия вируса при помо­щи гомологичной иммунной сыворотки. Факт нейтрализации вируса антителами устанавливают, заражая различные чувстви­тельные биологические объекты: лабораторных животных, кури­ные эмбрионы, культуры клеток. Технические детали РН в виру­сологической практике подробно изложены в соответствующем курсе.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Освоить технику постановки реакции нейтрализации по выяв­лению и идентификации токсинов С. perfringens.

Контрольные вопросы

1.В чем сущность реакции нейтрализации?

2.Какие применяют варианты реакции нейтрализации?

3.Каким образом устанавливают тип бактериального токсина в РН?

Тема 20