Методы определения факторов неспецифической резистентности и оценки иммунного статуса макроорганизма

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами тестирования факторов неспецифической резистентности и методами оценки иммунного статуса животного организма.

Оборудование и материалы. Культура Е. coli на МПА стериль­ный МПБ, стерилизатор, шприцы и иглы, спиртово-водный ра­створ метиленового синего, нормальная и иммунная (противо-эшерихиозная) кроличьи сыворотки, стерильные пастеровские пипетки, 1%-й агар Дифко, ацетоновый порошок М. lysodeicticus (или культура), стерильные чашки Петри, кристаллический лизо-цим, фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,2...7,4, эритро­циты барана, стерильный физиологический раствор, веронал-мединаловый буферный раствор с рН 7,3...7,4, гемолизин, компле­мент морской свинки, дистиллированная вода, фотоэлектроколориметр, пластины с результатами радиальной иммунодиффузии по определению иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови, калибровочная кривая для определения содер­жания иммуноглобулинов разных классов; препараты для под­счета Е-РОК и ЕАС-РОК.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Методы определения факторов неспецифической резистентнос­ти макроорганизма. Защиту макроорганизма от возбудителей ин­фекционных болезней обеспечивает не только иммунная систе­ма, но и механизмы неспецифического порядка: непроницае­мость слизистых и кожных покровов, фагоцитоз, бактерицид­ное действие лизоцима, а также гуморальные факторы: комплемент, пропердин и др. Все эти механизмы (факторы не­специфической резистентности) представляют собой первую линию противоинфекционной защиты, поскольку при первич­ном контакте с возбудителем иммунный ответ развивается толь­ко спустя некоторое время.

Количественное определение лизоцима в сыворотке крови. Лизоцим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомоле­кулярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тканях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), дей­ствует бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и актив­ность лизоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus.

Готовят 1%-й агаровый гель (Дифко) на 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар темпе­ратурой 60...70°С вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты пере­мешивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В застывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.

Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разво­дят в 1/15 М ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5; 1; 3; 5, 10; 20; 40 и 70мг/мл. По 0,05 мл каждого разведения лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 °С и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок.

По полученным данным строят калибровочную кривую, от­кладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса.

Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1:5, вно­сят по 0,03 мл в лунки и далее поступают, как при определении активности стандартного лизоцима. Измерив диаметр зоны ли­зиса, по калибровочной кривой вычисляют содержание лизоци­ма в исследуемой пробе.

Количественное определение комплемента в сыворотке крови. Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса анти­ген — антитело (АГ — AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс АГ • АТ+С1+С4+С2+Сз+С5+С6+С7+С8+С9. В процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой, внутрь клетки осмотически по­ ступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое раз­рушение клеток (антигенов) под влиянием антител и комплемен­та получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с лизоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощают­ся фагоцитами.

Количество комплемента в крови (сыворотке крови) опреде­ляют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроци­тов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам бара­на. Приготовление этих компонентов изложено в теме 17. Эрит­роциты барана, обработанные гомологичными антителами и чув­ствительные в таком состоянии к литическому действию комплемента, называют гемолитической системой. Количество комплемента измеряют в 50 % гемолитических единицах (СН50). За единицу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °С обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-я сус­пензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с рН 7,3...7,4+ гемолизин в тройном титре).

Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,1 мл), добавляют ФСБР до 0,5;мл, вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят конт­роль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл гемсистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают при 37°С 30 мин, охлаждают при 2...4'°С 10 мин, центрифугируют при 3000 мин^-1 15...20 мин, насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемо­лиза при помощи заранее построенной калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-й суспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллирован­ной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-й гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора готовят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-м гемолизом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают про­цент гемолиза, а на оси ординат — коэффициент экстинкции. СН5о вычисляют по дозе сыворотки, дающей гемолиз, наибо­лее близкий к 50 %. Для этого используют специальную фор­мулу (Крога) или, что проще, коэффициенты, рассчитанные по этой формуле (табл. 4).

Например, если исследуемая сыворотка в разведении 1 : 25 дает 30%-й лизис, то СН50 в 1 мл составит 25 • 0,844 = 21,1 ед.

Демонстрация фагоцитоза бактерий. К фагоцитирующим клеткам относят полиморфноядерные лейкоциты крови. Погло­щение микробной клетки фагоцитом может не сопровождаться гибелью микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или при­водить к внутриклеточному перевариванию захваченных бакте­рий (завершенный фагоцитоз).

Белой мыши внутрибрюшинно сначала вводят 2 мл стериль­ного МПБ, через два-три часа — 0,5 мл культуры эшерихий. Спу­стя 20...40 мин шприцем из брюшной полости отбирают экссу­дат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфи­ром, окрашивают метиленовым синим (экспозиция 2...3 мин). При микроскопировании можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (рис. 55).

Методы оценки активности фагоцитирующих клеток. Для оценки активности фагоцитов используют следующие показате­ли:

1) фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофильных лейкоцитов;

2) фагоцитарное число — сред­нее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоци­том (характеризует интенсив­ность фагоцитоза).

Рис. 55. Фагоцитоз стафилококков: 1 — фагоциты; 2 — свободные стафилококки; 3 — фагоцитированные стафилококки

Определение фагоцитарного показате­ля: в чистую стерильную цент­рифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-го раствора цитрата на­трия, 0,1 мл крови, взятой у морской свинки или кролика, и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, Е. coli или др. (концентрация 0,5 • 109 клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдержива­ют при 37...38 "С 30 мин, затем центрифугируют при 2500...3000 мин-1 15...20 мин до образования прозрачного слоя плазмы, слоя эритроцитов и тонкого сероватого среднего слоя лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, делают три—пять мазков и окрашивают по методу Романовского—Гимзы. Препарат микроскопируют, подсчитыва­ют не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.

Определение фагоцитарного числа: в маз­ках, которые были приготовлены для определения фагоцитарно­го показателя, подсчитывают 100 нейтрофильных лейкоцитов и суммарное количество захваченных ими бактериальных клеток, затем определяют фагоцитарное число. Например, 100 лейкоци­тов поглотили 500 бактериальных клеток, следовательно, фаго­цитарное число равно 500 : 100 = 5.

Определение опсоно – фагоцитарного ин­декса. Интенсивность фагоцитоза повышается благодаря ан­тителам — опсонинам, взаимодействующим с микробными клет­ками. Чтобы определить опсоно-фагоцитарный индекс, сравни­вают активность фагоцитов в нормальной и исследуемой (им­мунной) сыворотках.

Пастеровской пипеткой набирают на высоту капилляра около 2 см сначала суспензию бактериальных клеток (0,5 • 10⁹/мл), за­тем лейкоцитов и, наконец, исследуемую сыворотку. На пред­метном стекле компоненты перемешивают при помощи пипет­ки, затем вновь набирают в капилляр, конец которого запаивают. Капилляр помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. После ин­кубирования смесь выливают на предметное стекло, готовят ма­зок и окрашивают его метиленовым синим (1 мл насыщенного спиртового раствора на 30 мл дистиллированной воды).

Аналогичным образом готовят препарат с нормальной (конт­рольной) сывороткой. Оба препарата микроскопируют, просмат­ривают 100 нейтрофильных лейкоцитов, определяют количество фагоцитированных бактерий, рассчитывают фагоцитарное число в каждой сыворотке и затем опсоно-фагоцитарный индекс ис­следуемой сыворотки. Например, в 100 лейкоцитах нормальной сыворотки фагоцитировано 200 бактерий, следовательно, фаго­цитарное число 200: 100 = 2. В 100 лейкоцитах исследуемой им­мунной сыворотки захвачено 500 бактерий и фагоцитарное число 500 : 100 = 5.

Опсоно-фагоцитарный индекс показывает, во сколько раз процесс фагоцитоза в иммунной сыворотке интенсивнее, чем в нормальной. Его вычисляют делением фагоцитарного числа иммунной сыворотки на фагоцитарное число нормальной сыворот­ки. В приведенном примере опсоно-фагоцитарный индекс соста­вит 5,0:2,0 = 2,5.

Методы оценки иммунного статуса макроорганизма. Работа им­мунной системы, как и любой другой системы организма, может нарушаться, что неизбежно повысит восприимчивость животно­го к инфекционным заболеваниям.

Методы оценки Т-системы иммунитета (клеточный иммуни­тет). Из числа существующих методов оценки Т-иммунитета наиболее известны следующие.

Метод «спонтанных розеток» (Е—РОК). Т-Лимфоциты несут на своей поверхности рецепторы, реагирующие с мембранными структурами эритроцитов барана. После сорбции эритроцитов Т-клетки приобретают форму «розетки», что позво­ляет выявлять их в популяции лимфоцитов. Реакцию проводят в три этапа.

Выделение лимфоцитов барана: в центрифужную пробирку наливают 2 мл разделяющего раствора, состоящего из 9%-го водного раствора фиколла и визотраста-370, доведенного до плотности 1,077 г/мл (соотношение 8:2). Затем на разделяю­щий раствор осторожно наслаивают 2...4 мл крови с гепарином (100 МЕ/мл), разведенной средой Игла в соотношении 1 : 2...1:4. Смесь центрифугируют при 600g и температуре 20 °С. Лимфоциты, сконцентрированные в виде беловатого слоя над разделяющим раствором, отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла (при 600g— 10 мин два раза, 200g — 10 мин один раз).

Инкубация: средой Игла концентрацию лимфоцитов доводят до 3 • 10⁶/мл. Готовят суспензию эритроцитов барана, эритроци­ты отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия (три раза), затем из них готовят 0,5%-ю суспензию в среде Игла. Далее смешивают по 0,5 мл суспензии лимфоцитов и эритроцитов, смесь центри­фугируют при 200g 5 мин и оставляют при 4 °С на 18 ч.

Учет реакции: осторожно покачивая пробирку, ресуспендиру-ют осадок (не перемешивая), каплю суспензии вносят в счетную камеру и исследуют методом фазово-контрастной микроскопии. Просматривают не менее 200 лимфоцитов и подсчитывают те клетки, к поверхности которых прикреплено более трех эритро­цитов (рис. 56), — естественные розеткообразующие клетки (Е— РОК).

Технология выращивания животных отражается на их физио­логическом состоянии и на количестве Т- и В-клеток в частности (табл. 5).

Выявление Т-хелперов и Т-супрессоров. Т-хелперы и Т-супрессоры несут на своей поверхности специфи­ческие антигены, которые можно обнаружить при помощи мы­шиных моноклональных антител (см. тему 20) в реакции непря­мой иммунофлуоресценции (см. тему 18). Лимфоциты, связав­шие моноклональные антитела, светятся по периферии клеток, что позволяет определить их количество при микроскопическом исследовании.

Методы оценки В-системы иммунитета (гуморальный иммуни­тет).Включают в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержа­ние в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител.

Количественное определение иммуно­глобулинов разных классов методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Количество и соотношение им­муноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Методика постановки реакции изложена согласно Ю. Н. Федорову (1981).

Иммунную сыворотку против антител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуе­мый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результа­те реакции антиген — антитело в зоне эквивалентности образу­ются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном (рис. 57). Диаметр кольца преципитации пря­мо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жид­кости.

В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее) разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов в В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 ря­дов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведе­ния стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (IgG, IgA) или 48 ч (IgM).

Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандарт­ной сыворотки, на оси ординат — значения концентраций имму­ноглобулинов (% или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципи­тации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают кон­центрацию соответствующего иммуноглобулина.

Количество иммуноглобулинов разных классов в биологичес­ких жидкостях варьирует в широких пределах (табл. 6).

Все методы определения В-лимфоцитов в крови основаны на выявлении на поверхности В-лимфоцита структур, специфичес­ких только для В-клеток: рецепторы к Fc-фрагменту иммуногло­булинов, рецепторы к С3-фракции комплемента, иммуноглобу- линовые рецепторы, а также специфические В-антигены.

Метод розеткообразования (ЕАС—РОК): эрит­роциты барана обрабатывают антителами гемолизина, затем комплементом. Образуется комплекс АГ—AT—С, содержащий компонент комплемента С3. Далее смешивают лимфоциты жи­вотного и обработанные эритроциты барана. Эритроциты за счет присутствующих на их поверхности молекул С3 избирательно сорбируются на В-лимфоцитах, образуя «розетки».

Другие методы основаны на выявлении рецепторов к Fc-фрагментам иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых детерминант на поверхности В-клеток. Рецептор к Fc-фрагменту иммуноглобулинов способен связывать агрегированный γ-глобулин, меченный флуорохромом, что можно в последующем уста­новить при помощи флуоресцентного анализа.

Используя меченные флуорохромом антиглобулиновые сыво­ротки или антисыворотки против иммуноглобулинов отдельных классов, например моноклональные антитела (см. тему 21), можно определить общее содержание В-клеток и дифференцировать клетки, несущие IgG-, IgA-, IgM-детерминанты.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Ознакомиться с фагоцитозом методом микроскопии мазков из перитонеального экссудата мышей после введения в брюш­ную полость культуры эшерихий.

2. Определить опсоно-фагоцитарный индекс иммунной сыво­ротки против Е. coli.

3. Оценить результаты титрования лизоцима в крови.

4. Ознакомиться с иммунным лизисом эритроцитов, определить содержание комплемента в сыворотке крови морской свинки.

5. Подсчитать количество Е—РОК лимфоцитов в готовых пре­паратах.

6. Оценить результаты реакции радиальной иммунодиффузии и рассчитать, используя готовую калибровочную кривую, содер­жание иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.

Контрольные вопросы

1. Из каких стадий состоит процесс фагоцитоза?

2. Что такое фагоцитарное число, фагоцитарный показатель, опсоно-фагоцитарный индекс?

3. Как определяют активность комплемента?

4. Какими методами определяют количество иммуноглобулинов разных классов в биологических жидкостях?

5. Какие методы применяют для оценки В- и Т-систем иммунитета?

Тема 15

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ: АГГЛЮТИНАЦИИ (РА), НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РИГА), КУМБСА (РК). ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с реакциями агглютина­ции, гемагглютинации и реакцией Кумбса, с техникой их поста­новки и учета результатов.

Оборудование и материалы. Культуры Е. coli различной серо-групповой принадлежности на МПА, О-агглютинирующие диаг­ностические эшерихиозные сыворотки, бруцеллезный роз-бенгал антиген, положительная бруцеллезная сыворотка, планшеты с результатами титрования иммунной сыворотки в РИГА, еди­ный бруцеллезный антиген, мерные пипетки.

Серологические реакции рассмотрены последовательно в пяти темах (№ 15... 19).

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Взаимодействие микробного антигена и антител носит строго специфический характер и направлено в животном организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие ан­тигена и антител in vitro при определенных условиях сопровожда­ют видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммун­ный лизис), что позволяет использовать АГ—АТ-реакции, полу­чившие название серологических (лат. serum — сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммун­ные сыворотки (антитела) известной специфической направлен­ности (диагностические). При помощи таких сывороток в серо­логических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в Организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение воз­будителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно ис­пользовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни.

Реакции агглютинации, непрямой гемагглютинации и Кумбса основаны на взаимодействии in vitro корпускулярных антигенов с антителами и способности образовавшихся комплексов выпадать в осадок. В качестве корпускулярных антигенов используют бак­териальные клетки или растворимые антигены, экстрагирован­ные из микроорганизмов и сорбированные на корпускулах носи­телей: эритроцитах, частицах латекса и т. д.

Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специ­фически взаимодействуют с гомологичными антителами (специ­фическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы анти­ген — антитело образуют крупные, видимые невооруженным гла­зом конгломераты, которые выпадают в осадок — агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). Антигены и антитела взаимодействуют лишь в присутствии электролита (в 0,8%-м ра­створе хлорида натрия).

Реакция агглютинации (РА). Разработано несколько, вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исследованию и цели исследования.

РА на стекле. 1. Для идентификации микроорганизма на обез­жиренное предметное стекло наносят раздельно каплю извест­ной агглютинирующей диагностической сыворотки, например сальмонеллезной, и каплю физиологического раствора (конт­роль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раз­дельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2...4 мин.

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны от­сутствовать. При специфическом соответствии культуры бакте­рий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (поло­жительный результат), в случае отсутствия феномена агглютина­ции делают заключениё о том, что исследуемая культура бакте­рии не соответствует иммунной сыворотке.

2. Обнаружение антител в исследуемой сыворотке крови рас­смотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серо­диагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезно­го антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобно­го типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Пробирочная РА. 1. Обнаружение антител в сыворотке крови рассмотрим на примере РА для серологической диагностики бру­целлеза крупного рогатого скота. Схема постановки опыта приведена в таблице 7. Общий объем компонентов реакции 1 мл.

Одновременно по аналогичной схеме исследуют заведомо по­ложительную и отрицательную сыворотки (положительный и от­рицательный контроли).

Учет результатов начинают с контрольных пробирок — не должно быть спонтанной (неспецифической) агглютинации в 6-й пробирке (контроль антигена) и хлопьев осадка в 1-й про­бирке (контроль сыворотки). В остальных пробирках наличие и интенсивность агглютинации учитывают визуально и оценивают в крестах: 1) (++++)— полная агглютинация — хорошо выра­женный осадок и полное просветление жидкости (агглютиниро­вало 100 % антигена); 2) (+++) — неполная агглютинация с хоро­шо выраженным осадком и со слабой опалесценцией жидкости (агглютинировало 75% антигена); 3) (++) —частичная агглюти­нация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная (аг­глютинировало 50 % антигена); 4) (+) — очень небольшой оса­док, жидкость непрозрачная (агглютинировало 25 % антигена); 5) (—) — отсутствие агглютинации, осадка нет, жидкость мутная.

За положительный результат принимают агглютинацию мини­мум на два креста. Максимальное разведение исследуемой сыво­ротки крови, обеспечивающее агглютинацию минимум на два креста или более, называют титром сыворотки. Титр сыворотки отражает количественное содержание антител в крови исследуе­мого животного.

Из приведенного примера (табл. 8) видно, что антиген специ­фичен, так как отсутствует спонтанная агглютинация с физиоло­гическим раствором и нормальной (отрицательной) сывороткой, и активен — взаимодействует с заведомо положительной сыво­роткой. Следовательно, можно учитывать результаты РА с иссле­дуемой сывороткой крови. Титр исследуемой сыворотки (титр антител) в данном случае составляет 1 : 200.

Пробирочную РА используют не только для серодиагностики инфекционных болезней, но также для оценки активности диаг­ностических агглютинирующих сывороток или интенсивности поствакционального иммунологического ответа.

Количество антител может служить диагностическим критери­ем. Под диагностическим титром понимают минимальное количе­ство антител к данному антигену в исследуемой сыворотке, заве­домо превышающее количество нормальных антител к используе­мому в реакции антигену в сыворотке животного того же вида. При диагностическом титре антител и выше животное рассматри­вают как больное или переболевшее. При некоторых инфекцияхэтот подход не всегда продуктивен, и тогда исследуют «парные сыворотки», т. е. сыворотки, взятые от животного дважды с ин­тервалом три-четыре недели, причем первую пробу необходимо брать не позднее двух-трех суток после появления клинических симптомов болезни. На активный инфекционный процесс ука­зывает существенное повышение титра антител во второй пробе.

2. Для идентификации микроорганизмов используют проби­рочную РА, если из-за антигенного родства с различными вида­ми или внутривидовыми сероварами в РА на стекле микроорга­низм идентифицировать не удалось.

Например, если культура Е. coli дает в РА на стекле положитель­ный результат одновременно с иммунными сыворотками против нескольких О-серогрупп, ее испытывают как антиген с теми же сы­воротками уже в пробирочной РА и относят к той О-серогруппе, с сывороткой которой она дает максимальные титры (см. тему 29).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Данную реакцию относят к серологической реакции осадочного типа. В ней используют растворимые микробные антигены, сорбирован­ные на эритроцитах как носителях (антигенный диагностикум), или сорбированные на эритроцитах антитела известной иммунной сыворотки (антительный диагностикум). Антигенные диагности-кумы применяют для серологической диагностики, антитель­ные — для обнаружения антигенов в исследуемом материале.

Приготовление антигенных диагностикумов. Дефибринированную кровь отмывают ФСБР (рН 7,2) три раза. Для стабилизации (фиксации) эритроциты обрабатывают формальдегидом, глутаровым или акриловым альдегидом. Наиболее распространена формалинизация эритроцитов: 50%-ю суспензию эритроцитов сме­шивают с 50%-м раствором формалина в соотношении 1:1, вы­держивают, периодически встряхивая, при 37 ºС 2 ч и затем от­мывают ФСБР три раза.

Эритроциты легко сорбируют на своей поверхности полисаха­риды, а после обработки танином и белки. Танинизацию прово­дят, смешивая 2,5%-ю суспензию эритроцитов и раствор танина (1 :20 ООО) в соотношении 1:1с последующим выдерживанием при 37 °С в течение 15 мин. Затем эритроциты отмывают ФСБР (три раза) и доводят концентрацию до исходной. Для сенсибили­зации 1 мл 2,5%-й взвеси отмытых таннизированных эритроци­тов объединяют с 1 мл антигена и 4 мл ФСБР (рН 6,4) и выдер­живают при 37ºС 2 ч. После сенсибилизации эритроциты отмы­вают три раза и суспендируют в ФСБР (рН 7,2), который содер­жит 1 % нормальной кроличьей сыворотки, обеспечивающей стабильность суспензии. Следует отметить, что оптимальное ко­личество антигена для сенсибилизации эритроцитов определя­ют опытным путем в каждом случае.

Обнаружение антител в сыворотке крови. Сыворотку крови перед исследованием инактивируют в водяной бане при 56 °С 30 мин и проверяют на наличие антител к антигенам собственно эритроцитов. Для удаления антиэритроцитарных антител исследуемую сыворотку крови предварительно адсорбируют несенсибилизированными эритроцитами.

РНГА на стекле применяют для диагностики пуллороза — тифа птиц (качественная кровекапельная реакция непря­мой гемагглютинации — ККРНГА). На сухое обезжиренное стек­ло глазной пипеткой наносят антиген и свежую кровь (в соотно­шении 1:1), взятую из гребня или подкрыльцовой вены птицы, и смешивают, покачивая стекло. Реакцию считают положительной при выпадении в течение двух минут в смеси крови с антигеном хлопьев коричневого цвета. Параллельно ставят контроли с по­зитивной и негативной сыворотками.

Пробирочная РНГА рекомендована для серологи­ческой диагностики многих инфекционных болезней. Например, для диагностики сальмонеллезов используют количественную РНГА. Эритроцитарный антиген содержит О-антигены сальмо­нелл. Исследуемую сыворотку разводят физиологическим ра­створом в полистироловых планшетах в объеме 0,5 мл от разведе­ния 1: 100 до 1 : 800. Затем в каждую лунку вносят 0,25 мл диагностикума. Компоненты перемешивают покачиванием планшета и выдерживают в термостате при 37 ºС 2...2,5 ч. Результат РНГА оценивают в крестах (рис. 58): 1) (++++) —все эритроциты аг­глютинированы и в виде «зонтика» покрывают дно лунки; 2) (+++) — агглютинированы почти все эритроциты. На фоне «зонтика» сформировано малозаметное кольцо из осевших неаг-глютинированных эритроцитов; 3) (++) или (+) — «зонтик» пло­хо выражен, заметен осадок из неагглютинированных эритроци­тов в виде кольца; 4) (—) — эритроциты не склеены и осели на дно в виде узкого колечка с ровными краями либо в виде пунктата или колечка.

Параллельно ставят контроли с заведомо положительной и от­рицательной сыворотками. Реакция Кумбса (РК). Данная серологическая реакция также основана на феномене агглютинации. Предназначена для выяв­ления так называемых «неполных» антител, у которых только один активный центр, и по этой причине они могут специфически взаимодействовать с детерминантами антигена, но реакция не завершается формированием макроскопически видимых комп­лексов антиген — антитело. В частности, РК используют для се­родиагностики бруцеллеза животных. Предварительно сыворот­ки крови исследуют в обычной пробирочной РА. Исходя из ре­зультатов РА, для исследования берут пробирки с разведениями сыворотки, где нет агглютинации, но возможно произошло спе­цифическое связывание «неполных» антител с бруцеллезными антигенами. Антиген из этих пробирок отмывают от несвязавшихся (свободных) белков сыворотки крови центрифугировани­ем. К отмытому осадку корпускулярного бруцеллезного антигена добавляют 1 мл разведенной антиглобулиновой сыворотки, со­держащей антитела к иммуноглобулинам сыворотки крови жи­вотных того вида, который исследуют на бруцеллез. Пробирки со смесью выдерживают при 37 ºС 18 ч, затем при комнатной темпе­ратуре 2...4 ч.

Учет результатов: в положительном случае бруцеллезный ан­тиген будет агглютинировать, так как полные антитела антигло­булиновой сыворотки взаимодействуют с «неполными» антите­лами на поверхности бруцелл и вызывают агглютинацию корпус­кул антигена.

Оборудование для постановки серологических реакций. При массовых серологических исследованиях, определении титра сы­вороток используют оборудование, с помощью которого можно облегчить процедуру разведения сывороток, внесения компонен­тов реакции: автоматические пипетки, аппарат Флоринского, микротитратор «Такачи».

Аппарат Флоринского: благодаря групповой авто­матической пипетке (рис. 59) одновременно разводят 10 сыворо­ток крови или вносят компоненты в 10 стандартных серологи­ческих пробирок, размещенных в 100-гнездном штативе (10 х 10).

Микротитратор «Такачи» включает в себя поли­стироловые пластины (129 x 93 мм) с лунками, разбавители — уст­ройства для взятия и разведения сывороток в объеме 0,025 и 0,05 мл, стеклянные пипетки-капельницы для разлива предусмот­ренных условиями опыта объемов растворителя. При помощи стеклянных пипеток, на которые надета капельная насадка в виде пластмассового конуса со стальной трубочкой внутри, разливают по лункам пластины физиологический раствор либо буферный раствор в объеме 0,025 мл (одна капля) или 0,05 мл (две капли). Капли определенного объема (0,025 мл) формируются при усло­вии, что пипетку держат строго вертикально на расстоянии 1 см от пластины (рис. 60, а). Затем при помощи разбавителей берут необходимое количество сыворотки крови. Разбавитель представляет собой тонкие металлические стержни с наконечниками полусферической формы, состоящими из пластин с верти­кальными прорезями. Ось стержня выступает впереди наконеч­ника, что предохраняет его от повреждений. Обычно одновре­менно используют несколько разбавителей и держат их веерооб­разно (рис. 60, б). Головки разбавителей с сывороткой помещают в лунки первого ряда, вращая ось, перемешивают сыворотку с раствором, затем переносят разведенную сыворотку в следую­щий ряд лунок, обеспечивая при этом ее разведение в два раза и т.д. (рис. 60, в). На завершающем этапе в лунки с помощью ка­пельной пипетки вносят остальные компоненты реакции (рис. 60, г). Эти приспособления можно применять при постановке многих серологических реакций (РА, РСК, РНГА и т. д.).

Для внесения компонентов реакции в лунки планшетов все чаще используют 4-, 8- и 12-канальные автоматические пипетки с изменяющимися объемами (5...250 мкл) и пласти­ковые наконечники.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Идентифицировать культуры эшерихий и сальмонелл в РА на стекле с О-агглютинирующими сыворотками.

2. Определить титр положительной бруцеллезной сыворотки в пробирочной РА.

3. Учесть результаты титрования позитивной сыворотки в РНГА.

Контрольные вопросы

1.Какие типы антигенов используют в РА?

2.В чем сущность феномена агглютинации?

3.Что такое качественная и количественная РА?

4.Каким образом неизвестный микроорганизм идентифицирует в РА?

5.Как определить титр сыворотки крови в пробирочной РА?

6. Каким образом получают эритроцитарные диагностикумы для РНГА? 7. В чем сущность реакции Кумбса?

Тема 16

РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП): КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ (РКП), ДИФФУЗИОННОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП); ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Цель занятия. Ознакомить студентов с сущностью и техникой постановки реакций кольцепреципитации, диффузионной пре­ципитации, методом иммуноэлектрофореза. Рассмотреть их практическое использование.

Оборудование и материалы. Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка, стандартный сибиреязвенный антиген, стериль­ный физиологический раствор, пипетки Пастера, пробирки Уленгута, 1,5%-й агаровый гель с мертиолатом (конечное разве­дение 1:10 000), стерильные чашки Петри, камера для иммуно­электрофореза, готовые иммунофореграммы, штампы для РДП.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Реакция преципитации (РП), как и реакция агглютинации, принадлежит к разряду серологических реакций осадочного типа, но в отличие от РА в ней используют не корпускулярные, а растворимые антигены микроорганизмов. Образование комплек­сов антиген — антитело сопровождается изменением оптической плотности среды (помутнением) — преципитацией (от лат. praecipitatio — падение вниз), что расценивают как положитель­ный результат реакции.

Антиген для РП готовят из чистых культур микроорганизмов, если антиген предназначен для серодиагностики, или из ткане­вого материала, содержащего микроорганизмы, если РП ставят, чтобы при помощи известной иммунной сыворотки обнаружить возбудитель в патологическом материале.

Физические методы экстрагирования антигенов основаны на механическом разрушении микробных клеток посредством рас­тирания с кварцевым песком, встряхивания на шюттель-аппарате в колбе со стеклянными шариками, многократного заморажи­вания и оттаивания или воздействия ультразвуком. Полисахаридные термостойкие антигены выделяют термической обработкой (кипячением, автоклавированием).