Биофизические и биохимические методы

Биолюминесценция

Биолюминесценция (от био и лат. lumen – свет, + -escent – суффикс, означающий слабое действие) широко распространена в природе и известна у бактерий, грибов, представителей разных типов животных – от простейших до хордовых. Биолюминесценция – это видимое свечение живых организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности и обусловленное у значительного числа видов ферментативным окислением особых веществ – люциферинов. У многоклеточных организмов (ракообразных, насекомых, рыб и др.) свечение часто обусловлено симбиотическими бактериями. Свечение может испускать вся поверхность тела или специальные органы. Продолжительность свечения варьирует от длительного, продолжающегося часы, до коротких вспышек, измеряемых у некоторых организмов долями секунды.

Для целей биодиагностики используют различные светящиеся организмы, измеряя специальными приборами изменение интенсивности свечения под действием токсикантов. Наиболее часто в качестве биоиндикаторов используют морские люминесцентные бактерии. Морские люминесцентные бактерии легко культивируются, они обладают быстрым, объективным и количественным характером отклика на интегральное воздействие ксенобиотиков. Отклик люминесцентных бактерий на токсические вещества достоверно коррелирует с таковым у других биологических организмов, а величина 50% тушения свечения (ЕС50) достоверно коррелирует с величиной 50% летальной дозы (LD50) для человека.

Интенсивность свечения измеряется специальными приборами люминометрами. Введение в реакционную смесь пробы с токсическим соединением вызывает спад свечения.Уровень тушения биолюминесценции пропорционален концентрации токсических веществ.

Методы биолюминесценции предпочтительны в качестве первичных тестов и способны быстро ответить на вопрос: присутствуют или нет в среде токсические агенты в концентрации, опасной для человека и других живых организмов.

Биолюминесцентные методы обладают хорошей чувствительностью к разнообразным химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (тяжелые металлы, фенолы, формальдегид, пестициды и т. д.).

Фотосинтетическая активность

Первичная продукция, характеризующая исходный уровень биологической продуктивности, а соответственно, и дальнейшее продвижение вещества и энергии по пищевым цепям, в подавляющем большинстве экосистем образуется за счет фотосинтеза.

Фотосинтез – это образование клетками высших растений, водорослей и некоторыми бактериями органических веществ из неорганических с использованием энергии света и при участии пигментов: хлорофиллов, бактериохлорофиллов и некоторых других. Интенсивность и характер фотосинтетической активности является важнейшим показателем физиологического состояния растений.

Одним из способов оценки интенсивности процессов фотосинтеза служит компьютеризованная флуориметрия, основанная на измерении интенсивности люминесценции хлорофилла.

Фотосинтетическую активность оценивают по изменению интенсивности флуоресценции хлорофилла при переходе фотосинтетического аппарата из активного состояния в неактивное.

Флуоресцентный метод контроля широко используют не только для определения фотосинтетической активности. Так, при анализе сточных вод, он позволяет определить суммарное количество органических веществ в воде по величине интегральной флуоресценции в области 390–560 нм. Флуоресцентный метод также используют при определении содержания нефтепродуктов в водной среде.

На базе флуоресцентных методов в сочетании с лазерной оптикой разработаны приборы для дистанционного контроля состояния экосистем и содержания в них отдельных загрязняющих веществ. Эти методы наряду с другими используются в космическом мониторинге.

2) Генетические методы

Анализ генетических изменений может быть использован для оценки состояния среды. Появление таких изменений характеризует мутагенную активность среды, а возможность их сохранения в клеточных популяциях отражает эффективность иммунной системы организма.

В нормальных условиях большая часть генетических аномалий удаляется из популяции посредством иммунной системы организмов. Наличие таких аномалий можно использовать в качестве индикатора стресса, ведущего к продукции аномальных клеток и снижению способности иммунной системы организма их уничтожать. В качестве генетических изменений в соматических клетках обычно рассматривают различные структурные изменения хромосом, а также аномалии в количестве хромосом (анеуплоидию) и др.

Для создания тест-системы были сконструированы специальные штаммы сальмонеллы. На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколичественные и количественные тесты для оценки мутагенной активности.

Оценка результатов производится исходя из следующих критериев. Если количество колоний на опытных чашках превышает число колоний на контрольных чашках без мутагена не более чем в 1,7 раза, делается заключение, что мутагенная активность не выявлена. Если наблюдается превышение в 1,7–10 раз, делается вывод о слабой, в 10–100 раз – о средней, более чем в 100 раз – о сильной мутагенной активности препарата.

В опытах было показано, что 90% из 175 известных канцерогенов, выявленных в опытах на животных, проявили мутагенную активность в тесте на сальмонелле. Это – высокая чувствительность теста.

Следует отметить, что именно с использованием теста Эймса было проведено наиболее тщательное и систематическое сопоставление мутагенной и канцерогенной активности большого числа химических соединений.

3) Биоэнергетические методы

Обнаружить снижение качества среды, пока загрязнения не оказали необратимого повреждающего воздействия на организм, позволяет биоэнергетический подход.

Биоэнергетические методы основаны на том, что любой физиологический процесс требует затрат энергии. Количество энергии, затрачиваемой организмами на все физиологические процессы в единицу времени, является отражением интенсивности энергетического метаболизма, которая может быть измерена методом респирометрии. Такие анализы позволяют установить ранние изменения в физиологическом гомеостазе.

Количество энергии, расходуемой на процессы роста особи в стрессовых условиях, всегда выше, чем в оптимальных, из-за дополнительных затрат энергии на компенсацию таких воздействий. Таким образом, количество энергии, расходуемой во время роста, является характеристикой качества среды.

4) Иммунологические методы

В последнее время иммунологические методы нашли широкое применение во многих фундаментальных и прикладных науках.

Традиционно иммунологические методы применяются в клинико-диагностических исследованиях при различных патологиях человека. однако современные научные данные свидетельствуют о том, что у всех исследованных организмов от человека до низших беспозвоночных животных иммунологические реакции во многом сходны.

При изменении условий среды обитания, возникновении заболеваний или антигенного воздействия наблюдаются достоверные изменения в составе и численности иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, макрофагоподобных клеток и др.) и, как следствие, появление в полостных жидкостях цитотоксических белков и антимикробных пептидов.

Применение иммунологических методов при изучении иммунозащитных реакций у рыб и беспозвоночных животных

Показано, что врожденный иммунитет млекопитающих во многом соответствует таковому у низших позвоночных и беспозвоночных животных и представляет собой совокупность реакций неспецифической антимикробной защиты, которая действует практически без латентного периода, с высокой эффективностью и избирательностью распознования «своего» и «чужого». Антимикробные белки фагоцитов, гемоцитов и жидких сред организмов являются физиологически активными веществами, участвующими в реализации и обеспечении взаимодействия защитных реакций при фагоцитозе, воспалении и стрессе.

При ухудшении условий среды обитания и при атаке чужеродных агентов, как в полостных жидкостях беспозвоночных животных, так и в сыворотке крови позвоночных происходит резкое нарастание фагоцитирующих клеток и, как следствие, антимикробных белков и катионных полипептидов, которые осуществляют нейтрализацию стресса или гибель внедрившихся чужеродных агентов.

Исследование динамики реакций врожденного иммунитета у водных животных, в частности определение концентрации гемоцитов и лизоцима, обнаружение новых белков в сыворотке и полостных жидкостях, сравнение этих параметров с нормой, позволяет достоверно обнаруживать изменение условий среды обитания или появление заболеваний.

В качестве наиболее часто используемых тест-объектов можно назвать радужную форель (Oncorhynchus mykiss), у которой исследуют сывороточный лизоцим – фактор неспецифического иммунитета рыб (определяют его концентрацию и сравнивают концентрацию фермента в контрольных и опытных группах); моллюсков (мидия Mytilus edulis) – у них исследуют гемолимфу и взвесь клеток печени; иглокожих (морская звезда Asterias rubens) и некоторых ракообразных, у которых исследуют полостную жидкость.

5) Морфологические методы

Морфологические изменения, как правило, сопутствуют достаточно длительному воздействию загрязнителей на экосистемы и наблюдаются, в первую очередь, у организмов, наиболее чувствительных к данному виду загрязняющих веществ.

Флуктуирующая асимметрия

Флуктуирующей асимметрией называют небольшие ненаправленные различия между правой и левой сторонами различных морфологических структур, в норме обладающих билатеральной симметрией.

При нормальных условиях развитие защищено от таких случайностей и асимметрия минимальна.

При стрессе эффективность защитных механизмов снижается, что приводит к повышению уровня асимметрии. Например, исследуется разница между количественными признаками (числом шипиков, члеников, пятен, жилок, и т. п.) на правой и левой половине тела у животных, взятых с загрязненных и чистых (контрольных) территорий. При анализе асимметрии широко используются стандартные статистические методы.

Фенодевианты

Фенодевиантами называются фенотипы – варианты проявления признака, отличающиеся от условно нормального, обычно встречающегося в природе. Их появление обычно является результатом значительных нарушений развития.

Например, загрязнение радионуклидами и тяжелыми металлами увеличивает число соцветий с малым числом язычковых цветков у поповника обыкновенного.

Частота встречаемости отклоняющихся от нормы фенотипов в популяции служит показателем эффективности гомеостаза развития.