Подсчет количества эритроцитов и клиническая оценка результатов

Эритроциты, также как лейкоциты и тромбоциты относятся к форменным элементам крови. Подсчет их количества проводят при общем клини­ческом анализе крови наряду с оценкой СОЭ, определением концентрации гемоглобина, выведением лейкограммы и расчетом индексов красной крови, к которым относят цветовой показатель (ЦП) и содержание гемоглобина в одном эритроците (СГЭ).

Эритроциты - самые многочисленные форменные элементы крови, кото­рые содержат гемоглобин. Следовательно, их основная функция в организ­ме - осуществление газообмена. С помощью гемоглобина эритроциты пере­носят кислород и углекислоту. Кроме того, эритроциты доставляют клет­кам аминокислоты и липиды, принимают участие в регуляции кислотно-ще­лочного равновесия, выполняют защитную и другие жизненно важные функ­ции, которые более подробно рассматривали в курсе физиологии.

Содержание эритроцитов в крови здоровых животных и птицы довольно постоянное, поэтому установление изменения их количества имеет диаг­ностическое значение. Правда, колебания их числа можно наблюдать в за­висимости от времени суток исследования, возраста, пола, продуктивнос­ти, физической нагрузки животного. Так, например, количество эритроци­тов днем несколько меньше чем вечером, у новорожденных их содержание выше чем у взрослых, также как и у самцов по сравнению с самками. У высокопродуктивных коров показатели содержания эритроцитов выше чем у малопродуктивных. Установлено также, что у лошадей после физической нагрузки (например 10-минутная прогонка рысью - проба по Домрачеву) число эритроцитов увеличивается на 20 и более процентов.

Все эти факторы необходимо учитывать при клинической оценке ре­зультатов определения количества эритроцитов. Для подсчета эритроцитов предложено несколько методов, из которых унифицированными в медицинс­кой практике являются два:

1. Подсчет в счетной камере с применением микроскопа;

2. Подсчет посредством электронных автоматических счетчиков. Ранее практиковались методы определения числа эритроцитов с помощью эритроседиометра (градуированной пробирки для определения СОЭ по Нево­дову), эритрогемометра и фотоэлектроколориметра, однако, из-за низкой их точности, в настоящее время они не используются. Погрешность же метода подсчета форменных элементов в камере составляет + 2-5%, а в ав­томатических анализаторах и того меньше - до + 2%. Это и предопределя­ет широкое применение названных методов не только в лабораторной прак­тике, но и в научных исследованиях.

Подсчет эритроцитов в камере. Принцип метода заключается в том, что точное количество крови равномерно смешивают с определенным коли­чеством жидкости. Разведенную кровь помещают в камеру с известным объ­емом. На дно камеры нанесена сетка, благодаря которой возможен точный подсчет эритроцитов посредством микроскопии.

Предложено несколько счетных камер, из которых наибольшее расп­ространение в странах бывшего СССР получила счетная камера с стекой Горяева. Ее нередко так и называют "камера Горяева", хотя фактически это камера Бюркера с сеткой Горяева (1910).

Счетная камера - это толстое предметное стекло с четырьмя попе­речными желобками, между которыми расположены три плоскости. Средняя плоскость на 0,1 мм тоньше боковых и разделена продольным желобом на две равные половины, на каждой из которых выгравирована сетка Гряева. Если на боковые плоскости камеры наложить покровное стекло и притереть его до появления радужных колец, т.н. "колец Ньютона", то над средней плоскостью будет щелевидное пространство высотой 1/10 мм.

Сетка Горяева имеет размер 3х3 мм, т.е. ее площадь равна 9 мм². На ней нанесено 225 больших квадратов, 25 из которых разделены на 16 маленьких, 100 квадратов не разграфлено и еще 100 разделены на прямоу­гольники. Площадь одного маленького квадратика составляет 1/400 мм², а объем камеры над ним - 1/4000 мм³.

Что касается техники подсчета эритроцитов, то здесь соблюдают следующую последовательность этапов: 1) разведение крови; 2) заправка счетной камеры; 3) собственно подсчет клеток; 4) расчет абсолютного количества эритроцитов.

1 этап. Поскольку эритроцитов в крови содержится значительное ко­личество, например у коровы массой 400 кг - более 125 млрд. клеток, то определить их количество возможно только после разведения крови. Для разведения чаще применяют 0,85-3%-й раствор натрия хлорида или 5%-й раствор натрия цитрата. Применение растворов большей или меньшей кон­центрации недопустимо, поскольку приведет к разрушению эритроцитов.

Кровь разводят или в меланжере-смесителе для эритроцитов, или в пробирке (по Н.М.Николаеву, 1954). Меланжер представляет собой капил­лярную трубочку длиной 10 см с шаровидным расширением. Внутри расшире­ния находится шарик, который способствует равномерному перемешиванию крови и жидкости. Поскольку предложены меланжеры как для эритроцитов, так и для лейкоцитов, то цвет этого шарика может быть различным: крас­ный шарик - это меланжер для эритроцитов, белый - для лейкоцитов.

Для исследования используется как стабилизированная кровь, так и нестабилизированная сразу же после взятия. Кровь набирают в меланжер до метки "0,5" или "1". Конец смесителя очищается ваткой от крови и сразу же набирается до метки "101" разбавляющая жидкость. Отверстия смесителя закрывают большим и средним пальцами и перемешивают в тече­ние 2-3 мин., после чего удаляют на вату первые три капли, а четвертую вносят в счетную камеру. Если кровь набирали до метки "0,5", то полу­чают разведение в 200 раз, если до "1" - в 100 раз.

При пробирочном способе разведения крови берут 4 мл раствора нат­рия хлорида и вносят в пробирку. Капилляром от гемометра Сали набирают 0,02 мл крови и выдувают в пробирку, затем несколько раз промывают ка­пилляр раствором. Разведенную при этом в 200 раз кровь тщательно пере­мешивают.

2 этап. Камеру располагают горизонтально и заполняют так, чтобы вся поверхность, на которую нанесена сетка, была заполнена жидкостью. При этом не должно быть образования пузырьков воздуха. После заполне­ния камеру оставляют строго в горизонтальном положении в течение 1 ми­нуты для оседания эритроцитов на дно.

3 этап. Подсчет эритроцитов проводят под микроскопом, лучше при среднем увеличении (объектив х40, окуляр х7) при несколько затемненном поле, чтобы лучше просматривались линии сетки. Учет клеток ведется в пяти больших квадратах, разделенных на 16 малых. Начинают подсчет с верхнего левого большого квадрата сетки. Затем переходят к следующему квадрату, расположенному по диагонали, затем аналогично к следующему и т.д. Есть и другой принцип подсчета - в 4-х квадратах по углам и в 1-м квадрате в центре сетки.

Подсчет клеток в большом квадрате начинают с верхнего левого малого квадратика. Затем переходят ко второму, третьему и четвертому квадратику того же ряда. Сосчитав клетки первого ряда, переходят на второй и считают в обратном порядке. Таким образом подсчитывают эрит­роциты во всех 16 малых квадратиках и переходят к следующему большому квадрату.

Чтобы избежать повторного учета эритроцитов в большом квадрате существует два правила их подсчета:

1) подсчитываются все эритроциты, лежащие внутри квадрата и на его левой и верхней линиях. Клетки, лежащие на правой и нижней линиях, подсчитываются с другими квадратами. В крайних правых квадратах как верхних, так и нижних, клетки, лежащие на правой и нижней линиях, подсчитываются с последними квадратами. Этот метод предусматривает подсчет только тех клеток, которые лежат внутри квадратов, на линиях и прилегают к ним с внутренней стороны. Эритроциты, лежащие вне квадрата не учитываются.

2) второй метод предусматривает подсчет в том же порядке, но от­личается от первого тем, что учитываются клетки, прилегающие к линиям не только изнутри, но и снаружи. Подсчет эритроцитов при этом ведется без учета таковых, прилегающих к правым и нижним линиям. По мнению большинства исследователей первый метод является более точным.

4 этап. Расчет абсолютного количества эритроцитов производится по формуле: Х = А^.Б/В^.Г, где

Х - количество эритроцитов в 1 мкл крови;

А - количество эритроцитов, подсчитанное в 5 больших квадратах;

Б - степень разведения крови (200);

В - количество маленьких квадратиков в 5 больших квадратах (80);

Г - объем счетной камеры над маленьким (1/4000 мм3).

Таким образом, формула имеет вид: Х = А^.10000. Например, в 5 квадратах количество эритроцитов 590, тогда в абсолютных единицах по­лучаем 5 900 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (сист. ед. СИ) необходимо результат умножить на 106, т.е. 5 900 000^.10⁶= 5,9.10¹²/л.

Подсчет эритроцитов посредством электронных автоматических счет­чиков. Эти методы получают все большее распространение, поскольку поз­воляют автоматизировать исследование, повышают его точность и исключа­ют субъективизм. Используются различные кондуктометрические счетчики, из которых наиболее известные типы это Культер (Франция), Целлоскоп (Швеция), Пикоскел (Венгрия) и др. Принцип работы таких счетчиков ос­нован на различии электропроводности форменных элементов крови и жид­кости, в которой они находятся. При этом клетки, проходя через микро­отверстие капиллярной трубки, изменяют сопротивление электрической це­пи, что регистрируется электромагнитным устройством. Число эритроцитов через 15-30 с высвечивается на цифровом табло.

В крови здоровых животных и птицы содержится следующее количество эритроцитов: крупный рогатый скот - 5,0-7,5; овцы - 7,0-12,0; козы - 12-18; лошади - 6,0-9,0; свиньи - 6,0-7,5; собаки - 5,2-8,4; куры - 3,0-4,0 на 10¹²/л.

Уменьшение числа эритроцитов (эритроцитопения, олигоцитемия) от­мечается наиболее часто при анемиях различного происхождения (постге­моррагических, гемолитических, железо- и витаминодефицитных, гипо- и апластических, которые связаны с нарушением кроветворения). Эритроци­топения развивается также при инфекционной анемии лошадей, гематурии крупного рогатого скота, при многих острых и хронических интоксикаци­ях.

Увеличенное содержание эритроцитов в крови - эритроцитоз (полици­темия) наблюдается чаще при заболеваниях, связанных с потерей организ­мом жидкости, в частности при диспептическом неонатальном и диарейном синдромах. Она бывает в начальную стадию инфекционных и лихорадочных заболеваний, при болевом абдоминальном синдроме, при пороках сердца в стадию декомпенсации, при отравлении фосфором, ртутью, окисью углеро­да, альвеолярной эмфиземе легких.

Лекция №5

Тема: ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ КРОВИ

План лекции:

1. Расчет индексов красной крови и их значение в дифференциальной диагностике анемий.

2. Анемический и полицитемический клинико-лабораторные синдромы.

3. Методы и клиническое значение определения количества лейкоцитов.

4. Показания к исследованию и методы подсчета количества тромбоцитов.

1. Расчет индексов красной крови и их значение

в дифференциальной диагностике анемий

При ряде заболеваний может происходить изменение насыщенности эритроцитов гемоглобином, что устанавливают посредством расчета индек­сов красной крови - цветового показателя (ЦП) и содержания гемоглобина в эритроците. ЦП дает представление об отношении концентрации гемоглобина к ко­личеству эритроцитов. Метод определения основан на сравнении получен­ных результатов с нормативными показателями здоровых животных.

ЦП рассчитывается по формуле: ЦП = Hb2.Е1/Hb1.Е2, где гемоглобин 1 и эритроциты 1 - это средние показатели у здорового животного данного вида и возраста; гемоглобин 2 и эритроциты 2 - это найденные показа­тели у исследуемого животного. Например:

У всех здоровых животных ЦП равен 1+0,15, т.е. пределы колебаний составляют от 0,85 до 1,15.

Для определения средней насышенности эритроцитов гемоглобином рассчитывают еще один индекс: СГЭ. При этом руководствуются формулой:

СГЭ = Hb (г/л):Е (10¹²/л).

СГЭ равно: у крупного рогатого скота - 15-20; свиней - 16-19; лошадей 17-20 пг.

Определение индексов красной крови имеет значение в дифференци­альной диагностике анемий. При подострой постгеморрагической анемиии, когда одновременно уменьшается содержание гемоглобина и количество эритроцитов, ЦП приближается к 1, а СГЭ такое же как и у здоровых жи­вотных. ЦП меньше единицы и снижение СГЭ, или гипохромия, бывает при алиментарной, а также при хронической посгеморрагической анемии. Для этих нозологических форм анемии симптом гипохромии является типичным. Гиперхромия, это когда ЦП больше единицы и увеличивается СГЭ, - харак­терный признак гемолитической анемии, поскольку значительно уменьшает­ся количество эритроцитов.

2. Анемический и полицитемический клинико-лабораторные синдромы

Во внутренней патологии животных выделяют следующие основные группы анемий: 1) пост­геморрагические (после кровопотерь); 2) гемолитические (на почве уси­ленного разрушения эритроцитов); 3) гипо- и апластические (связанные с нарушением кроветворения); 4) железо- и витаминодефицитные, или али­ментарные (на почве недостаточности железа, витамина В₁₂ и фолиевой кислоты).

Анемия – клинико-гематологический синдром, характеризующийся уменьшением концентрации гемоглобина, чаще при уменьшении числа эритроцитов в единице объема крови. Характерной особенностью истинной анемии является либо функциональная недостаточность системы эритроцитов в силу пониженного содержания гемоглобина в каждой клетке, либо абсолютное уменьшение эритроцитарной массы (гиповолемия).

Анемия почти всегда вторична и является проявлением какого-то заболевания. Патогенетическим механизмом анемии может быть любое заболевание, приводящее к уменьшению количества крови в организме в результате либо острой или хронической кровопотери, либо усиленного разрушения крови (гемолиз), либо нарушения образования эритроцитов в костном мозге. При многих болезнях и патологических состояниях анемия, ее глубина и характер является ведущим синдромом и определяет прогноз заболевания.

Симптомы анемии: бледность слизистых оболочек и кожи; одышка; тахикардия со стучащим сердечным толчком; гипохромемия (олигохромемия), эритроцитопения (олигоцитемия), увеличение СОЭ. При глубокой анемии может развиться коллапс. Тяжелая гемолитическая анемия проявляется гемоглобинурией.

Анемическим синдромом у животных проявляются следующие патологические состояния и болезни: наружные и внутренние, острые и хронические кровотечения; отравления гемолитическими ядами и интоксикации; гемоспоридиозы; дефицит или нарушения усвоения железа, гиповитаминозы; нарушения эритропоэза; аутоиммунные и инфекционные заболевания с геморрагическим синдромом (см.), лучевая болезнь. Анемия развивается также при недостаточном кормлении животных.

Полицитемический синдром – патологическое состояние, характеризующееся увеличением количества форменных элементов в единице объема крови. Поскольку большая часть массы форменных элементов приходится на эритроциты, такое состояние нередко именуют эритремией, хотя этот термин правомочен лишь по отношению к системным абсолютным и первичным эритроцитозам, обусловленным патологией эритроидного ростка костномозгового кроветворения. Абсолютные эритроцитозы бывают обусловлены гипоксией, стенозом легочной артерии, метгемоглобинемией. Относительные (временные) эритроцитозы связаны с потерей организмом жидкости, стрессом, системной артериальной гипертензией, повышенной физической нагрузкой.

Симптомы полицитемического синдрома: темно-вишневая окраска слизистых оболочек, кровоизлияния; эритро- и лимфоцитоз; замедление СОЭ (у рогатого скота практически отсутствует); гепатомегалия у крупного рогатого скота, спленомегалия у лошадей.

Полицитемический синдром развивается при потере воды вследствие диареи, гипергидроза, образования транссудатов и экссудатов; при легочной недостаточности на почве бактериальных, вирусных и паразитарных пневмоний, хронической альвеолярной эмфиземы; при декомпенсированной сердечной недостаточности. Синдром может развиться при болезнях с непроходимостью желудочно-кишечного тракта (расширение желудка, метеоризм и энтералгия кишечника, илеус). Полицитемия типична для инфекционного энцефаломиелита лошадей.

3. Методы и клиническое значение определения количества лейкоцитов

Лейкоциты, или белые кровяные тельца, в организме выполняют прежде всего защитную функцию. В зависимости от форм они участвуют в фаго­цитозе, выработке интерферона, лизоцима, прпердина, гистамина и других биологически активных веществ. Лимфоциты играют основную роль в специ­фических защитных реакциях - формировании клеточного и гуморального иммунитета.

Для подсчета лейкоцитов предложены два метода:

1. Подсчет в счетной камере (ошибка метода +7%).

2. Подсчет в автоматических счетчиках (ошибка +2%).

При подсчете лейкоцитов используют ту же камеру с сеткой Горяева, что и для эритроцитов. Разводят кровь жидкостью Тюрка в меланжере или в пробирке. Состав жидкости Тюрка: 100 мл 3%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего. Ее назначе­ние состоит в том, чтобы разрушить эритроциты и окрасить лейкоциты.

При разведении в меланжере набирают кровь в смеситель для лейко­цитов до метки "0,5" или "1", а до метки "11" - жидкость Тюрка и пере­мешивают в течение 2-3 мин. Получают разведение соответственно в 10 или 20 раз. Для разведения пробирочным методом в пробирку отмеривают 0,4 мл жидкости Тюрка и в нее вносят 0,02 мл крови, которую набирают капилляром Сали. Содержимое пробирки тщательно перемешивают.

Заполнение счетной камеры проводят также как и при подсчете эрит­роцитов. Через 1-2 мин., после оседания лейкоцитов на дно камеры, про­водят подсчет лейкоцитов в 100 больших неразграфленных квадратах. Рас­чет абсолютного количества клеток производят по формуле:

Х = А.Б/В.Г, где

Х - количество лейкоцитов в 1 мкл крови;

А - количество лейкоцитов, подсчитанное в 100 больших квадратах;

Б - степень разведения крови (20);

В - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (1600);

Г - объем счетной камеры над маленьким (1/4000 мм3).

Таким образом, формула имеет вид: Х = А*50. Например, подсчитано 180 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 9 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (сист. ед. СИ) необ­ходимо результат умножить на 10⁶, т.е. 9 000*10⁶= 9*10⁹/л.

Принцип подсчета лейкоцитов посредством автоматических счетчиков такой же как и при определении числа эритроцитов.

В крови здоровых животных и птицы содержится следующее количество лейкоцитов: крупный рогатый скот - 4,5-12,0; овцы - 6,0-14,0; козы - 8,0-17,0; лошади - 7,0-12,0; свиньи - 8,0-16,0; собаки - 8,5-10,5; ку­ры - 20,0-40,0 на 10⁹/л.

Увеличение количества лейкоцитов в крови - лейкоцитоз - может быть физиологическим, медикаментозным и патологическим. Физиологичес­кий лейкоцитоз бывает при беременности, после физических нагрузок, после приема корма у плотоядных, при стрессе. Медикаментозный лейкоци­тоз наблюдается после парентерального введения животным белковых пре­паратов, вакцин, сывороток, алкалоидов и т.д.

Патологический лейкоцитоз отмечается при гнойно-воспалительных процессах, сопровождающих целый ряд внутренних болезней: бронхопневмо­нию, пневмонию, плеврит, перикардит, ретикулоперитонит и др. Выражен­ный лейкоцитоз наблюдается при многих инфекционных болезнях, лейкозах, хирургической инфекции. Возникает он и при отравлении животных ртутью, мышьяком, передозировке камфары.

Снижение числа лейкоцитов - лейкцитопения - является результатом угнетения органов кроветворения, их истощения, пониженной реактивности организма. Лейкоцитопения развивается в результате инфекционных забо­леваний (классическая чума свиней, инфекционный энцефаломиелит лоша­дей, сальмонеллез, стахиботриотоксикоз и др.), радиационных поражений, передозировки препаратов (сульфаниламидов, левомецитина, синтомицина и др.). Выявление лейкоцитопении при заболеваниях, для которых характе­рен лейкоцитоз, указывает на сниженную естественную резистентность ор­ганизма и тяжелое течение болезни.