Проведение рентгенофлуоресцентного анализа почвенных образцов
Подготовленная почва взвешивалась, отбиралась навеска необходимой для анализа массы, после чего на специальной пресс-форме формировались «таблетки».
Определение элементного состава почв проводилось при помощи рентгено-флуоресцентного анализатора ElvaX с оригинальным программным обеспечением.
Рисунок 1 – Ренгенофлуоресцентный анализатор ElvaX [17].
После проведения рентгенофлуоресцентного анализа нами были получены протоколы исследования, которые содержат информацию о количественном элементном составе почвы. На основании полученных данных мы составили таблицу 3, с помощью которой становится возможным анализировать влияние отдельных элементов, а также определять характер такого воздействия.
Таблица 3 – Таблица для анализа влияния отдельных элементов почвы
| железо | калий | кадмий | свинец | цинк | хром | медь | кобальт | никель | хлор | кальций | марганец | сера | ||||
| Пункт 1 | Н | ↑ | Н | Н | ↑ | Н | Н | Н | ↓ | Н | ↑ | Н | Н | |||
| Пункт 2 | ↑ | Н | Н | Н | ↑ | Н | Н | ↑ | Н | Н | Н | Н | ↑ | |||
| Пункт 3 | Н | Н | ↑ | ↑ | ↑ | ↑ | ↑ | Н | ↑ | ↓ | Н | Н | ↓ | |||
| Пункт 4 | ↓ | Н | ↑ | ↑ | ↓ | ↑ | ↑ | Н | ↑ | Н | Н | ↑ | Н | |||
| условные обозначения | Н | содержание элемента в пределах нормы | ||||||||||||||
| ↓ | содержание элемента ниже нормы | |||||||||||||||
| ↑ | содержание элемента выше нормы | |||||||||||||||
Энергетические и нефтехимические комплексы выбрасывают в атмосферу окислы Аl, Fe, Mn. отходы металлургических производств содержат РЬ, Cr, Mn: отходы металлообрабатывающих и машиностроительных заводов – РЬ, Zn, Ni, Сu, Мn, Cr. Автомобильные и железные дороги способствуют накоплению в почвах РЬ, Сu, Zn, Ni и других токсикантов.
Например, источниками повышенных концентраций кадмия, свинца, никеля, цинка в придорожных почвах и растениях являются бензин, автомобильное масло и шины. Известно, что цинк может поступать в атмосферу при стирании автомобильных шин, для вулканизации которых он используется. Детали и механизмы автомобилей, которые подвергаются изнашиванию и коррозии в процессе эксплуатации, также могут служить источниками тяжелых металлов в окружающей среде. Так, хром, никель, медь, свинец входят в состав применяемых в автомобилестроении сталей и чугунов в качестве легирующих компонентов [18, 19].
На почве, отобранной из каждого пункта, в чашках Петри нами были посажены по 100 семян Allium cepa. В качестве контроля нами была использован питательный раствор. Питательный раствор содержит все необходимые элементы для нормального развития растений.
Проращивание семян проводилось в течении 10 суток. Так, стоит отметить, что уже после 7 суток во всех чашках Петри проросло 100% семян. Затем мы срезали корешки лука и проводили фиксацию. Фиксацию проводили в пенициллиновых пузырьках в ацетоуксусном фиксаторе (3 части 96% спирта: 1 часть ледяной уксусной кислоты). В этом фиксаторе в холодильнике можно сохранять материал в течении длительного времени. Материал окрашивали в 2% р-ре ацетокармина. Растительные ткани предварительно мацерировали в 3-нормальной соляной кислоте при комнатной температуре не более 15 мин, с последующим 5-минутным промыванием водой. Для окрашивания объекты оставляли на ночь в холодильнике. При использовании экспресс-метода окрашивание и мацерацию можно проводить одновременно, нагревая объекты в красителе на кипящей водяной бане 10 мин. Для лучшего прокрашивания размер объектов не должен превышать 1-2 мм.
При изготовлении препаратов мы использовали технику временных давленых препаратов, для окантовки препаратов применяли глицерин.
Далее мы проводили микрокопирование получившихся препаратов клеток апикальной меристемы лука и сохраняли получившиеся фотоснимки (рисунок 2).
Рисунок 2 – Препараты клеток апикальной меристемы лука
Рисунок 3 – Клетка апикальной меристемы лука, находящаяся в состоянии интерфазы
Чаще всего нам встречались клетки, находящиеся в интерфазе (рисунок 3)
Также нам встречались клетки, находящиеся на различных стадиях нормального митотического деления (рисунок 4).
 |  |
| Профаза | Метафаза |
 |  |
| Анафаза | Телофаза |
Рисунок 4 – Клетки апикальной меристемы лука, находящиеся на различных стадиях митотического деления
После подсчета количества клеток на различных стадиях клеточного цикла мы рассчитывали митотический индекс. Митотический индекс (МИ)— процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток.
МИ=(П+М+А+Т)/число анализируемых клеток
Митотический индекс характеризует пролиферативную активность клеток корневой меристемы, которая в свою очередь может подавляться или стимулироваться за счет компонентов, находящихся в почве [20, 21]. Важным является наличие непосредственного контакта клеток корня с почвой. Анализ активности пролиферации может характеризовать условия среды. Целью данного раздела исследований является изучение влияние элементного состава почвы на геном Allium cepa. Полученные нами значения МИ приведены в таблице 4 и на рисунке 5.
Таблица 4 – Значения митотического индекса
| Номер образца | МИ |
| пункт 1 | 0,18 |
| пункт 2 | 0,20 |
| пункт 3 | 0,12 |
| пункт 4 | 0,09 |
| К (контроль) | 0,23 |
Рисунок 5 –значения митотического индекса
При анализе рисунка мы можем видеть, что наибольшее значение величины МИ характерно для контрольного образца. Это и справедливо, т.к. помимо того, что питательный раствор сбалансирован по количеству необходимых растению элементов, он еще не содержит никаких вредных компонентов таких как, например, тяжелые металлы. Меньше всех по величине МИ от контрольного образца отличается пункт 2. Здесь почва была отобрана в частном секторе, элементный состав также можно считать благополучным, т.к. все ключевые элементы содержатся в количествах, соответствующих нормальному содержанию. Концентрации тяжелых металлов в почве, отобранной в пункте 2, также находятся в пределах нормы или снижены. Такая обстановка в целом может считаться благополучной для живых организмов.
При выращивании семян на почве, отобранной в пункте 1, значение МИ составило 0,18. В целом, экологическая обстановка и в этом пункте не характеризуется существенными нарушениями, что, свою очередь подтверждается и проведенным элементным анализом почв, по результатам которого большая часть интересующих нас элементов находится в пределах нормального содержания. Однако наблюдается снижение концентрации никеля и повышенная концентрация кальция и калия по сравнению с нормой. Но, как мы можем видеть, это не вызывает существенного снижения величины МИ в данном образце.
Противоположная ситуация наблюдается для пунктов 3 и 4. Так, здесь мы видим, что значения МИ составляют всего 0,12 и 0,09 соответственно, что в свою очередь свидетельствует об угнетении процессов развития растений, выращиваемых на почвах, отобранных в этих точках. Действительно, указанные почвы характеризуются повышенным содержанием кадмия, свинца, никеля и некоторых других токсичных для живых организмов элементов. Этот факт обуславливает низкую пролиферативную активность клеток апикальной меристемы лука. А наличие токсичных элементов в почвах в свою очередь связано с тем, что данные точки сбора образцов находятся в местах с интенсивным автотранспортным движением (проспект Дзержинского), а также комбинированным автротранспортным и промышленным воздействием (АЗС, Долгобродская).
Кроме токсического действия на живые организмы, тяжелые металлы также могут оказывать повреждающее действие на генетический аппарат клетки. Так, из литератруных источников известно, что клетки апикальной меристемы высших растений по чувствительности и реакциям на негативные воздействия окружающей среды схожи с клетками млекопитающих, что делает возможным смоделировать и выявить степень нагрузки на окружающую среду при анализе степени цитогенетических нарушений в клетках растения.
Генотоксический эффект можно зафиксировать также при микрокопировании клеток апикальной меристемы лука. Так, существуют следующие патологии митоза растительной клетки: формирование мостов, одиночных и двойных фрагментов, опережение или отставание хромосом при расхождении, выпадение хромосом, наличие трехполюсных митозов и микроядер в клетках, а также ядерных протрузий (рисунок 6) (Крапивина, Экологический вестник).
Таблица 5 иллюстрирует частоту клеток (%) с цитогенетическими нарушениями, рассчитанных на 500 ана-телофазных клеток.
Таблица 5 - Число выявленных аберраций разного типа и их относительный вклад в общий спектр аберраций
| проба | всего аберраций на 500 ана-телофаз | % от общего числа аберраций | ||
| отставание | опережение | мост | ||
| 33,3 | 16,7 | |||
| 17,4 | 82,6 | |||
 |  |  |
| Двойной фрагмент | Микроядро | Трехполюсный митоз |
 |  |  |
| Отставание хромосом | Мост | Ядерная протрузия и микроядро |
 |  |  |
| Опережение хромосом | Опережение хромосом и мост | Выпадение хромосомы |
Рисунок 6 – Патологии митоза клеток апикальной меристемы лука
Нами также был проведен анализ генотоксичности почв. Мы проводили подсчет числа хромосомных аберраций в клетках корешков лука.
Из всех вышеупомянутых аберраций в процессе работы нам преимущественно встречались клетки с микроядрами (рисунок 8), а также с опережением (рисунок 7) и отставание хромосом при расхождении (рисунок 9).
Рисунок 7 – Примеры аберрантных клеток с опережением хромосом
Рисунок 8 – Примеры аберрантных клеток с микроядрами
Рисунок 9 – Примеры аберрантных клеток с отставанием хромосом
Мы рассчитывали отношения числа аберрантных к общему числу клеток, находящихся в процессе деления. Нами были получены результаты, представленные на рисунке 10.
Рисунок 10 – Частота клеток с аберрациями в различных пунктах
Нарушения нормального деления клетки не является автоматически признаком неблагополучия среды, в которой находится живой организм. Так, даже при идеальных условиях в клетках апикальной меристемы лука встречается небольшой процент клеток с аберрациями. Так, в нашем эксперименте этот факт также имеет место, а частота клеток с аберрациями равна 0,02. Данное значение является нормальным.
Повышенными, по сравнению с контролем, значениями числа аберрантных клеток характеризуются растения, произраставшие на почвах, отобранных в пунктах 1 и 2. Однако процент клеток с нарушениями митоза в этих пунктах также нельзя считать значительным. Поэтому ситуация для вышеупомянутых пунктов вполне благополучная.
А что касается пунктов 3 и 4, то здесь мы наблюдаем абсолютно противоположную картину. Вероятно, тяжелые металлы, содержащиеся в почвах, отобранных в этих пунктах, оказали существенное генотоксическое действие на клетки модельного растения и наряду со сниженной пролиферативной активностью в данных пунктах наблюдается существенное увеличение частоты нарушений нормального деления клеток по сравнению с контролем.
ВЫВОДЫ
Оценка реакций индикаторных признаков тест-объектов заключалась в оценке влияния состава почвенных вытяжек высшие растения (на примере Allium cepa).
Реакции тест-объекта Allium cepa оценивались по степени влияния элементного состава почв на значение митотического индекса клеток апикальной меристемы, а также на основании данных, полученных при анализе цитогенетических нарушений в клетках корней Allium cepa.
Максимальное значение митотического индекса клеток апикальной меристемы наблюдалось для пункта 1 (парк имени Горького), элементный состав в данной точке также можно считать благополучным, т.к. все ключевые элементы содержатся в количествах, соответствующих нормальному содержанию. Такая обстановка в целом может считаться благополучной для живых организмов.
Обращают на себя внимание почвы, отобранные по проспекту Дзержинского и ул. Долгобродской, для которых значение МИ крайне низкое, что может отражать токсичное действие компонентов соответствующих почв и свидетельствовать об угнетении процессов развития растений, выращиваемых на почвах, отобранных в этих точках. Действительно, указанные почвы характеризуются по результатам РФ анализа повышенным содержанием кадмия, свинца, никеля и некоторых других токсичных для живых организмов элементов. Этот факт обуславливает низкую пролиферативную активность клеток апикальной меристемы лука. А наличие токсичных элементов в почвах в свою очередь связано с тем, что данные точки сбора образцов находятся в местах с интенсивным автотранспортным движением (проспект Дзержинского), а также комбинированным автротранспортным и промышленным воздействием (АЗС, Долгобродская).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Суммируя полученные в процессе работы данные, можно сделать вывод о том, что элементный состав почв отражает уровень антропогенной нагрузки на окружающую среду. Биологическое тестирование с помощью тест-объектов позволяет быстро и эффективно установить характер такого воздействия. Так, одна и та же почвенная вытяжка по-разному влияет на индикаторные признаки различных тест-объектов. Она может оказывать стимулирующее действие на процессы роста и пролиферации микроорганизмов, и в то же время оказывать токсическое действие на высшие растения. Одновременно, наличие мутагенных веществ в почвах не является показателем, на основании которого можно говорить об общей токсичности почвы, т.к. та же вытяжка может оказывать стимулирующее влияние на рост микроорганизмов и самих высших растений.
Полученные нами данные позволяют заключить, что использование Allium cepa в качестве организма-биоиндикатора позволяет комплексно оценить влияние состава почвы с учетом вклада каждого отдельного компонента, а также их комбинированного эффекта, что позволяет более объективно оценить степень антропогенной нагрузки на среду.