Операционно-ламинарные боксы.

Если нет шкафа, то стерильный стол.

Ламинарный бокс для стерильных манипуляций.

В нерабочее время помещение кварцуют, в т.ч. внутри ламинарного бокса.

Рабочую поверхность бокса и стола протирают спиртом или формалином. Стерильный стол используют при отсутствии ламинарного бокса, и при его использовании на каждый край ставят горелку Бунзена или спиртовку.

Термостатируемая комната.

Где есть устройство кондиционирования,t=25 2⁰C. Режим освещения в зависимости от требований к растущим культурам. Напр. для некоторых культур нужен свет. Для этого используют стеллажи с трубчатыми лампами, под каждым стеллажом на потолке. Могут быть шкафы для культур с теневым выращиванием, в этом случае применяемые обычные закрытые шкафы или все комнаты могут сделать темной.

Суспензионные культуры не должны слипаться, поэтому их должны выращиваться при постоянном перемешивании в качалках, которое делают (оборот в секунду и отклоняют ось вращения на несколько см по вертикали). В качалках или в самой комнате может быть установлен режим смены дня и ночи.

Компоненты сред.

Каждая среда независимо от назначения имеет 6 компонентов:

1.микроэлементы

2.макроэлементы

3.источник железа

4.источник углерода

5.витамины

6.стимуляторы роста, которые подбираются к каждому виду.

Ауксины:

ИУК(индолилуксусная кислота)

ИМК(индолилмасляная кислота)

НУК(нафтилуксусная кислота)

НОУК(хлорфинилоксиуксусная кислота)

Цитокинины:

6-БАП-(6-бензиламинопурин)

2-ИП(изопентиламинопурин)

Кинетин (фурфуриламинопурин)

Зеатин.

Гиббереллины:

ГК (гибберелловая кислота)

ИУК окисляется продуктами метаболизма тканей, его нельзя использовать как единственный ауксин.

Зеатин и ГК- термолобильны и их нельзя автоклавировать.

Одним из компонентов среды, дающие ей желирующие свойства являются , напр. (из водорослей) его кладу 6 гр на 1 л среды.

Подбор регуляторов роста:

0 1 2 3 4 5 А 0

А-3-4

Ц-3-4

Ц

МС-(мурасиге-скуга)

Приготовление сред.

Среды: высокосолевые (Мурасиге-Скуга, Шенка-Хиледебрандта); низкосолевые - (Уайта)

Среды либо готовят сами (в лаборатории), либо используют готовые порошки, в которых входят все компоненты, кроме сахарозы, агара и регуляторов роста. Но такие среды, несмотря на удобство, не могут быть изменены и дорого стоят. В лаборатории же имея стандартный набор посуды и необходимые реактивы можно приготовить любую среду.

Методика приготовления:

Берут пропись и готовят растворы исходных солей. Растворять их можно в химическом стакане на магнитной мешалке. В последствии растворы объединяют, и объем доводится до риски дважды дистиллированной средой. Все компоненты растворяются стерильной дважды дистиллированной водой. Все соли используют марки ХЧ - химически - чистые, ЧДА - чистые для анализа. Приготовленную среду разливают в конические колбы Эрленмейера по 250 мл, затыкают ватными пробками и оборачивают горлышко фольгой.

Автоклавируют при 115⁰С (до 150⁰С) и при давлении 1,1 атм (до 24) 20 мин(чем больше V, тем больше t).

Готовую среду остужают напр., в ламинарном боксе, где можно подлить термолабильные компоненты, а так же их там разливают по чашкам петри.

Готовую среду лучше не хранить во избежание заражения. Если же все-таки храним, то это делают 1 месяц с обязательным последовательным посевом, а лучше с пробой самих колб на стерильность. Для этого среду помещают в термостат при t-25⁰С на 4 дня. Если через 4 дня не проявляются признаки заражения грибами или микроорганизмами среду можно использовать. Среды, хранятся при t +4⁰С. Растворы основных солей +4⁰С, а витамины при -20⁰С хранятся 1 месяц (по 2 мл в колбочке).

Метод посеваприменяетсядля определения факта заражения сред, физиологических жидкостей, водных смывов с любых поверхностей(они со стен в операционных, автоклавной, и т.д.)).Для смыва со стен берут стерильную кисточку.

Эксплант- часть растения, которая должна быть по возможности наиболее молодой, чтобы не возникло трудностей, либо конкретная ткань, которую нужно размножить. Желательно чтобы эксплант был теристемой- вечно молодой тканью(кончик побега, корня, кисток). Размер экспланта зависит от размера его клеток , чем больше размер клеток, тем больше размер экспланта,т.к. существует критическое количество жизнеспособных клеток для каллусных культур. Перед тем как эксплант помещают на среду, его нужно отобрать и простерилизировать.

Стерилизация экспланта:

Эксплант должен быть стерилен, чтобы не заражать среду и одновременно жив, чтобы расти. Поэтому используют хлорсодержащие жидкости 1% активного хлора.

ПР: Раствор гипохлорита натрия. Для лучшего прилипания гипохлорита натрия и водоотталкивающим гидрофобным поверхностям используют смачиватели - детергенты (типол). При стерилизации некоторых тканей их даже оставляют набухать, напр., кожура семян, чтобы открылись микротрещинки.

Как правило, стерилизованный экплант идет в несколько этапов, т.е. замачивают в гидрохлорите натрия и промывают дважды дистиллированной водой, затем это может повторяться.

Выращивание эксплантов

В готовую среду, разлитую по чашечкам Петри вдавливают эксплант. Если лист кладут горизонтально, стебель вертикально. Если среда подобрана правильно, то через месяц можно будет разделить растущий каллус (растущая ткань в результате деления клеток, т.е. пролифирации). Каллус можно разделить на несколько частей с соблюдением правильного размера экспланта. Если можно разделить на 10 частей, то через 6 месяцев 1000000 каллусов.

В условиях клонирования настоящей коэффициент разложен ниже из за неизбежной мутации и деградации клонов, которые составляют некоторый %.

Этапы микроклонального размножения:

1.Выбор растения – донора, изоляция эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2.Собственно микроразмножение, когда получают максимальное количество жизнеспособных эксплантов.

3.Укоренение размножающихся побегов с последующей адаптацией к почве, а при необходимости - депонирование растений-регенерантов при t +2+10⁰С.

4.Выращивание растений в полевых условиях (in vivo).

На первом этапе используют антибиотики (тетрациклин, особенно у древесных, а так же преимущественно мурасиге-скуга, а так же ауксины и цитокинины). Преимущественно антиоксиданты применяются для подавления терпенов и полифенолов, которые выделяют хвоиные, либо вплоть до суток промывают экспланты, либо добавляют антиоксиданты в среду.

Второй этап собственно микроразмножение, когда добиваются получения максимального количества микроклонов с учетом неизбежного появления растений с ненормальным морфологией и генетикой используют так же среду мурасиге -скуга и регулятор роста. При данном культивировании с повышенным содержанием цитокининов они могут накапливаться и отравлять каллусы (кусочки растений) может быть подавлена пролифирация, а так же наблюдается обводнение побегов и ослабление укоренения. Проблема решается минимизацией цитокинина в растворе, либо чередование цикл с высоким и низким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы – укоренение и адаптация к почвенным условиям, а также высадка имеют основной состав среды, уменьшение концентрацию солей и применяя среду Уайта, уменьшая концентрацию сахара и исключают цитокинин. Для стимуляции корнеобразования вводят НУК и ИМК. Укоренения побегов проводят 2 способами:

1.Выдерживают микропобеги до суток в стерильном концентрате культивируемого на агаре без гормонов или даже сразу в почвенном субстрате (импульсная обработка).

2.непосредственная культивация микропобегов до месяца на среде, содержащей ауксин или даже в гидропонике, что может значительно повысить степень укоренения и упростить его, а так же адаптировать растения к среде. Целесообразно затенять нижнюю часть культивируемых сосудов черной материей или добавляется в среду активированный уголь. Выращивание растений и каллуссов в чашках Петри, пробирках называется in vitro.

Пересадка регенерантов в субстраты очень ответственное мероприятие которое приходится на весну, начало лета растения с 2-3 листьями и хорошо укоренившись осторожно извлекают из пробирок пинцетом, корни отмывают от агара, и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90⁰С в течение 2 часов. Состав субстрата: торф и песок 3:1., а так же торф – дерновая почва и перлит поровну, а также торф, песок, теозолит поровну. Растения - регенеранты выращивают в пикировочных горшочках, температурный режим в теплице 20-22⁰С, освещен, не более 5 тыс. люкс, влажность 65-90%. В домашних или лабораторных условиях горшочки накрывают стеклянными банками, которые постепенно открывают до полной адаптации через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившихся растения подкармливают солями мурасиге-скуга. По мере роста растения рассаживают в большие емкости, а дальше используют как обычный посадочный материал. Наиболее сложным процессом является адаптация пробирочных растений в почве, поскольку нарушена деятельность устьиц, а у некоторых растений в условиях in vitro отсутствуют корневые волоски, что приводит к обезвоживанию, поглощения минеральных солей. Поэтому крайне целесообразно искусственно микоризация. Индусы предложили простой метод предотвращения обезвоживания во время пересадки в полевые условия или в грунт: листья опрыскивали 50% водяным раствором глицерина или смесью парафина с диэтиловым эфиром 1:1. Метод помогает избежать применения тумана и обеспечить 100% приживаемость.

Методы (разновидности) МКР.

Основной метод-активация существующих меристем при снятии апикального доминирования (доминирующие верхушки).

2 пути: 1) Удаление верхушечных меристем стебля, чтобы убрать источники гармонов с последующим микрочередованием побега in vitro

2) Добавление в питательную среду цитокининов (6-БАП).

Полученные побеги отделяют от экспланта и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулируют пролиферацию (деление клеток) пазушных меристем, возникают побеги более высоких порядков. Используют метод для размножения плодовых культур, ряда древесных и множества травянистых. Из 1 меристемы 105 растений в год.

2 методиндукция возникающих адвентивных почек из ткани экспланта - основан на способности к регенерации любых организмов и тканей в единое целое растение. Питательная среда содержит 100% цитокинина, иногда 10% ауксина - самый распространенный метод для размножения цветов, овощей и др. Морфогенетическая активность экспланта продолжается до 4 лет, из 1 растения в год до миллиона в год.

3 метод дифференциация соматических клеток в зародышеподобные структуры, напоминающие обычные зиготические зародыши, которые получаются из экспланта. Основное отличие образовавшегося зародыша in vitro от in vivo в том, что соматический зародыш развивается из ткани экспланта асексуально вне зародышевого мешка и напоминает биполярную структуру с одновременным развитием стебля и корня.

Они проходят 3 стадии развития:

- глобулярная стадия;

- сердцевидная стадия;

-торпедовидная стадия, развивается в проросток.

Таким путем можно размножать часть древесных пород (дуб, ель…). Формирование эмбрионов происходит в 2 этапа. 1) дифферинциация клеток экспланта за счет добавления в среду ауксинов. 2) На следующей стадии сформировавшиеся клетки развиваются в эмбриоиды при отсутствии ауксинов в среде.

Соматический эмбриогенез происходит в тканях первичного экспланта и в каллусной культуре, как правило, эмбриогенез проводят в суспензионной культуре, однако при этом полностью исключается такой опасный этап как адаптация растений к среде, поскольку соматический зародыш копирует свойство настоящего. При использовании соответственной техники капсуляции эмбриоидов можно получить искусственные семена.

4 метод Дифференциация адвентивных почек в первичные пересадочные каллусные ткани. Метод используется очень редко, т.к., чреват накоплением мутаций, вплоть до полиплоидии, а также возможной низкорослостью и неправильным расположением листьев. Однако есть и положительные моменты, т.к., этот метод экономически эффективен, поскольку из каждой клетки может образоваться новое растение. Только так можно размножать растения в культуре тканей и в трех методах очень важен для селекции по хозяйственно-ценным признакам. Этот метод показан для растений со стабильной генетикой каллуса и слабой изменчивостью растений-регенерантов.