Определение количества эритроцитов в 1 мкл крови

Для подсчёта форменных элементов взятую из пальца кровь разбавляют в специальных смесителях, чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для подсчёта. Разбавленной кровью заполняют специальную счётную камеру и подсчитывают под микроскопом число форменных элементов. Зная объём камеры и разбавление крови, вычисляют число кровяных телец в 1 мкл цельной крови.

Для подсчёта форменных элементов используют счётную камеру Горяева. Она представляет собой толстое предметное стекло, в средней части которого находятся четыре желобка с тремя узкими площадками между ними. Средняя площадка ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесённые на стекло. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из них дополнительно расчерчены на 16 маленьких. Единицей отсчёта является маленький квадрат. Его сторона равна 1/20 мм, площадь - 1/20 х 1/20 = 1/400 мм². Объём разведённой крови, помещающийся над маленьким квадратом, равен 1/400 мм² х 1/10 мм =1/4000 мм³. Перед работой необходимо рассмотреть под микроскопом сетку.

Для разбавления крови используют меланжеры или смесители. Смеситель представляет собой капилляр с расширением в средней части. В расширенном участке находится стеклянная бусинка для перемешивания разведённой крови. На капиллярах нанесена градуировка - метки 0,5 и 1,0. Третья метка находится в смесителе: для подсчёта эритроцитов - 101, лейкоцитов - 11. Для забора крови на меланжер надевают резиновую грушу, сдавливанием и расправлением которой достигается насасывание в него и крови и разбавляющих растворов. Для подсчёта эритроцитов в меланжер набирают кровь до метки 0,5 и раствор до метки 101, при этом кровь разбавляется в 200 раз. В меланжер для подсчёта лейкоцитов набирают кровь до метки 1, а раствор - до 11, при этом кровь разбавляется в 10 раз.

При подсчёте эритроцитов в качестве разбавляющего раствора применяют 3% раствор NaCl. Эритроциты в нём сморщиваются и становятся заметнее. При подсчёте лейкоцитов кровь разбавляют 5% раствором уксусной кислоты. В этих условиях эритроциты разрушаются и в поле зрения остаются только лейкоциты (точнее, их ядра). Уксусную кислоту подкрашивают метиленовым синим, при этом ядра лейкоцитов становятся видны отчетливее.

В норме в 1 мкл крови человека содержится в среднем 4,5 - 5 млн эритроцитов (или 4,5 - 5 в 1л).

Камеру помещают под микроскоп и рассматривают сетку вначале при малом, а затем при большом увеличении.

Накрывают камеру покровным стеклом, притирая его края к стеклу камеры до появления радужных колец. Оставив камеру под микроскопом, прокалывают палец.

Первую выступившую каплю крови из пальца стирают ватным тампоном. Во вторую каплю погружают кончик смесителя для эритроцитов, держат его вертикально и набирают кровь до отметки 0,5, следя, чтобы в капилляр не попали пузырьки воздуха. Обтирают конец капилляра фильтрованной бумагой и быстро, пока кровь не свернулась, переносят его в чашку с раствором NaCI, продолжая держать смеситель вертикально. Набирают раствор до метки 101 (т.е. разводят кровь в 200 раз), после чего смеситель переводят в горизонтальное положение и кладут на стол.

Для подсчёта эритроцитов берут заполненный смеситель, зажимая нижний конец пальцем, снимают резиновую грушу и, зажав оба конца смесителя третьим и первым пальцами, в течение 1 мин перемешивают кровь. Выпускают из смесителя на вату три капли, а четвертую наносят на среднюю площадку камеры у края покровного стекла. Капиллярными силами капля сама втягивается в покровное стекло и заполняет камеру. Излишек раствора крови стекает в желобок. Если на сетку попал воздух или на боковых площадках оказался излишек раствора, камеру следует промыть дистиллированной водой, насухо вытереть и заполнить снова. Заполненную камеру ставят под микроскоп и, если форменные элементы расположены равномерно (что является показателем хорошего перемешивания крови), приступают к подсчёту. Считать эритроциты лучше при малом увеличении (объективе х 8), но использовать при этом окуляр х 15.

Для того чтобы получить наиболее точные данные, необходимо подсчитать число эритроцитов в пяти больших квадратах, расположенных в различных местах сетки, например, по диагонали. Подсчёт ведут в пределах маленького квадрата по рядам (от верхнего до нижнего). Во избежание двукратного подсчёта клеток, лежащих на границе между малыми квадратами, применяют следующее правило «К данному квадрату относятся эритроциты, лежащие как внутри квадрата, так и на его левой и верхней границах; эритроциты, лежащие на правой и нижней границах, к данному квадрату не относятся».

Подсчитав, таким образом, сумму эритроцитов в пяти больших квадратах (что составляет 80 маленьких), находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном маленьком квадрате. Зная, что объём пространства камеры над одним маленьким квадратом равен 1/4000 мм³, умножают найденное число на 4000. Получают число эритроцитов в 1 мм³ разведённой крови. Умножив на величину разведения (200), получают количество эритроцитов в 1 мм³ цельной крови.

Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Х = (Э ·4000 · 200) /80, где

Х - искомое число эритроцитов в 1 мм³ (мкл) цельной крови, Э - сумма эритроцитов в 80 маленьких квадратах.

В итоге полученное число эритроцитов записывают в пересчёте на 1 л крови, т. е. число миллионов эритроцитов, найденных в 1 мм³ (мкл) умножают на 10¹² .