Методика проведения эксперимента
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
по курсу «Основы биотехнологии»
ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
Методические указания
Волгоград 2003
УДК 576.6:579.6
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Основы биотехнологии»
/Cост. И.В.Владимцева, Т.В.Хохлова, О.В.Колотова, Л.В.Федотова
Волгоградский государственный технический университет.
Волгоград, 2003. - 12 с.
Методические указания включают сведения по воздействию ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы. Приводятся методы определения устойчивости бактерий различных таксономический групп к ультрафиолетовому облучению. Предназначены для помощи студентам при выполнении работы по курсу «Основы биотехнологии»
Печатаются по решению редакционно-издательского Совета Волгоградского государственного технического университета.
Рецензент
д-р хим. наук, проф. Тужиков О.И.
(с)
Волгоградский
государственный
технический
университет, 2003
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
1) Изучить методику определения влияния ультрафиолетового облучения на микроорганизмы.
2) Определить зависимость жизнеспособности микробной популяции от времени воздействия ультрафиолетовых лучей.
3) Сравнить устойчивость грамположительных и грамотрицательных бактерий к ультрафиолетовому воздействию.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
К ультрафиолетовой области спектра относится излучение с длиной волны менее 400 нм, однако излучением с длиной волны менее 180 нм пользуются редко, так как оно поглощается атмосферным кислородом. Воздействие на микроорганизмы ультрафиолетового излучения обычно вызывает повреждение (репарацию) или гибель клеток, увеличение частоты мутаций и индукцию образования бактериофагов. Наиболее эффективными являются лучи с длиной волны 260 нм. Эта длина волны совпадает с максимумом поглощения нуклеиновых кислот, поэтому считают, что биологическое действие ультрафиолетовых лучей, в основном, связано с их воздействием на нуклеиновые кислоты.
Устойчивость микроорганизмов к губительному действию ультрафиолетовых лучей различна. Эффективность влияния облучения определяется чувствительностью микроорганизмов и дозой облучения. Доза облучения зависит от мощности источника ультрафиолетовых лучей, от расстояния между ним и облучаемых микроорганизмом и от продолжительности облучения.
Ультрафиолетовые лучи имеют слабую проникающую способность и поглощается белками, нуклеиновыми кислотами и свободными основаниями, поэтому эффективность облучения микроорганизмов зависит и от свойств среды, в которой они находятся.
В лабораториях в качестве источника ультрафиолетового излучения обычно используют бактерицидные лампы (БУФ – 15 и другие). Излучателем в этих лампах служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления. Она испускает линейчатый спектр в ультрафиолетовой области, более 80% энергии которого приходится на длину волны 253,7 нм. Бактерицидная лампа обычно представляет собой стеклянную трубку длиной 45 см и диаметром 18 мм, смонтированную между двумя электрическими контактами и включаемую в сеть через дроссель.
Для лабораторных работ обычно используют 15-ваттную лампу, обеспечивающую на расстоянии 91, 5 см мощность дозы, равную 400 эрг/сек/см2.
Бактерицидные лампы изготовляют из специального стекла, пропускающего практически все излучение с длиной волны 253, 7 нм и задерживающего все волны с длиной короче 200 нм.
Таким образом удается резко уменьшить образование озона, оказывающего на человека токсическое воздействие при концентрации 0, 005 частей на миллион. Минимальная концентрация озона, обнаруживаемая по запаху, составляет примерно 0, 015 частей на миллион.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Изучение влияния ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы проводят методом высева на плотный питательный агар суспензии бактериальных клеток до и после их облучения для определения количества живых клеток и эффективности облучения. В качестве модели грамположительных микроорганизмов используют сенную палочку B.subtilus, грамотрицательных – кишечную палочку E. coli.
Перед постановкой опыта подписать по 4 чашки Петри для каждого вида бактерий с указанием вида микроорганизма, времени обработки, числа и номера группы.
Приготовить исходную суспензию обоих видов бактерий в стандартной стерильной пробирке с концентрацией 10 м.к/мл по оптическому стандарту мутности в объеме 3-4 мл.
Из исходной взвеси приготовить рабочую суспензию путем 10-кратного разведения в шести стерильных пробирках с физиологическим раствором (0,9% NаС1) в объеме 5 мл до концентрации 100 м.к./мл
В 4 стерильные подписанные чашки Петри перенести по 1 мл рабочей взвеси бактерий для обработки ультрафиолетовыми лучами. Одна из чашек является контрольной, остается на лабораторном столе и служит для определения количества бактерий в суспензии до облучения. Три другие чашки Петри поочередно подставить под бактерицидную лампу на одно и то же место и держать их открытыми в течение 30 секунд, 1 и 2 минут. Время засекатъ секундомером. Для предохранения от ультрафиолетовых лучей необходимо надевать солнцезащитные очки.
Залить опытные и контрольные взвеси микроорганизмов 10 мл расплавленного и остуженного до 40 – 500 С питательного агара, тщательно перемешать и дать застыть среде.
Чашки с засеянными средами поместить в термостат при 370С на 24 –36 часов
По окончании термостатирования подсчитать количество колоний на всех чашках. Вычислить количество погибших клеток после каждого периода облучения и выразить его в процентах от исходного числа живых клеток в исходной суспензии. Результаты экспериментов занести в таблицу.
| Название бактерий | Время облучения (сек) | Число колоний | Количество погибших клеток % |
3.2 ОТЧЕТ СТУДЕНТА ПО ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЕ ДОЛЖЕН СОДЕРЖАТЬ:
1) Цель работы.
2) Этапы выполнения работы.
3) Таблицу с результатами опытов.
4) Выводы о проделанной работе.
4. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ:
1) пробирки, содержащие микробные культуры на скошенном агаре;
2) стерильные пробирки;
3) стерильные чашки Петри;
4) питательный агар;
5) флакон со стерильным физиологическим раствором;
6) бактериологические петли;
7) спиртовки;
8) бактериальный стандарт мутности 10 единиц;
9) стерильные пипетки;
10) резиновые груши со шлангом;
11) бактерицидная лампа;
12) секундомер;
13) термостат;
ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ
1) Соблюдать правила работы с живыми культурами микроорганизмов в соответствии с общим инструктажем по технике безопасности в биотехнологической лаборатории.
2) Осторожно обращайтесь со стеклянной посудой.
3) Особую внимательность необходимо проявлять при работе с зажженными спиртовками.
4) Работу необходимо выполнять только на специально оборудованном столе в биотехнологической лаборатории.
5) Следует следить за тем, чтобы ни прямые, ни отраженные ультрафиолетовые лучи не попали в глаза, так как они вызывают острое воспаление роговицв глаза. При облучении суспензии микроорганизмов необходимо надевать солнцезащитные очки.
6) Растворы, содержащие взвеси бактерий, запрещается сливать в канализацию. Пробирки с микробными взвесями нужно сдать лаборанту или преподавателю.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1) От чего зависит эффективность воздействия ультрафиолетового облучения?
2) Каковы последствия ультрафиолетового излучения на микроорганизмы?
3) Какая область спектра обладает наибольшим бактерицидным действием?
4) Опишите конструкцию бактерицидной лампы.
5) Каковы особенности техники безопасности при работе с ультрафиолетовым облучением?
6) В чем заключается методика изучения влияния ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы?
7) Какова зависимость гибели клеток от длительности облучения?
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1) Мудрецова-Висс К. А., Чистяков Ф.М. Микробиология. – М.: Экономика.1971.
2) Мудрецова-Висс К. А. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Экономика, 1975.
3) Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. – М.: Мир, 1967.
4) Большой практикум по микробиологии. – М.: Высшая школа, 1962.
5) Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. – М.: Медицина, 1978. – 391 с.
6) Теппер Е.З. Практикум по микробиологии. – М.: Колос, 174 с.
7) Волова Т.Г. Экологическая биотехнология. – Новосибирск, 1997.– 352 с.