Свободноживущие азотфиксирующие бактерии

Процесс фильтрации атмосферного азота бактериями имеет большое значение для общего баланса азота в почве. Пополнение запасов азота идет за счет фиксации молекулярного азота воздуха микроорганизмами. Ассимиляцию молекулярного азота осуществляют прокариоты, которых в зависимости от их взаимоотношений с растениями делят на три группы: симбиотические азотфиксаторы (живущие в симбиозе с растениями), ассоциативные азотфиксаторы (ризосферные (корневые) и филлосферные (листовые) бактерии, формирующие ассоциации с различными видами небобовых растений) и свободноживущие почвенные азотфиксаторы (живущие независимо от присутствия растений, вне ризосферы, в почве пара и даже в почве дорог).

Среди свободноживущих азотфиксаторов интерес представляют виды рода Azotobacter. Азотобактер – облигатный аэроб, с качестве источника азота использует молекулярный азот, в качестве источника углерода – органические кислоты, углеводы и спирты. Наиболее распространены в природе три вида азотобактера.

Azotobacter chroococcum – в молодой культуре имеет палочковидные, подвижные клетки. В старой культуре клетки кокковидные, соединены в пары и сарциноподобные пакеты, обычно окруженные слизистой капсулой. Колонии на плотных питательных средах слизистые, растекающиеся или выпуклые, бесцветные или окрашенные в темно-коричневый до черного цвет.

Azotobacter agile – клетки шаровидной или слегка овальной формы. Расположены одиночно или парами. Колонии влажно-блестящие, гладкие. Выделяют в среду желтый или зеленоватый пигмент.

Azotobacter vinelandii – в молодой культуре клетки палочковидные, в старой – форма клеток шаровидная. Колонии гладкие, блестящие или слизистые. Микроб выделяет сине-зеленый флюоресцирующий пигмент, проникающий в субстрат.

Проведение анализа

Для определения наличия азотобактера используют метод посева комочков почвы на агаризованную среду Эшби (см. приложение 1). Стерильную питательную среду разливают в чашки Петри. После застывания и высушивания среды на пластинки раскладывают комочки почвы размером с просяное зернышко. Расстояние между комочками – 1 см. Количество комочков – 25. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 28-30^оС. На 5-7 сутки вокруг комочков почвы развиваются слизистые колонии азотобактера. Результаты заносят в таблицу. Для количественного учета азотобактера подсчитывают число комочков, давших начало колониям, и определяют их процент об общего числа комочков, засеянных на чашку Петри.

Из колоний готовят мазки, окрашивают фуксином и просматривают под микроскопом. Если колонии со временем приобретают бурую окраску, их относят к Azotobacter chroococcum, если они образуют зеленый флуоресцирующий пигмент, то в зависимости от морфологии их относят либо к Azotobacter agile, либо к Azotobacter vinelandii.

Таблица. Оформление результатов учета численности азотобактера

Вариант опыта	Повторность	Общее число комочков почвы	Число комочков почвы, давших колонии	Выделе-ние азото-бактера (%)
Парниковая почва
Серая лесная почва

Приложение 1

Прописи некоторых сред для культивирования микроорганизмов

Мясо-пептонный бульон (МПБ)

Для приготовления мясного бульона 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей заливают в эмалированной кастрюле 1л водопроводной воды и дают настояться 12ч при комнатной температуре или 1ч при 50-55⁰С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды. Фильтрат доливают до 1 л. К 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) и 5 г поваренной соли. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na₂CO₃ до посинения красной лакмусовой бумажки. После установления рН среду снова кипятят 5-10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывают через бумажный фильтр.

Мясо-пептонный агар (МПА)

К 1 л мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют 20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления – 100⁰С, затвердевания - 40 ^ОС).

Среда Чапека (г/л дистиллированной воды)

сахароза или глюкоза – 20,0

NaNO₃ – 2,0

K₂HPO₄ – 1,0

MgSO₄ 7H₂О – 0,5

KCl – 0,5

CaCO₃ – 3,0

агар – 20,0

После стерилизации среды перед тем, как разлить ее в чашки Петри, к ней добавляют стерильную молочную кислоту из расчета 4 мл на литр среды.

Среда Эшби (г/л водопроводной воды)

Маннит –20,0

K₂HPO₄ – 0,2

MgSO₄ 7H₂О – 0,2

NaCl – 0,2

K₂SO₄ – 0,1

CaCO₃ – 5,0

агар – 20,0

Среда Гетчинсона(г/л дистиллированной воды)

K₂HPO₄ – 1,0

CaCl₂ – 0,1

MgSO₄ 7H₂О – 0,3

NaCl – 0,1

FeCl₃ – 0,01

NaNO₃ – 2,5

После стерилизации среды в колбу вносят стерильный складчатый фильтр.

Среда Омелянского (г/л водопроводной воды)

NH₄Cl – 1,0

K₂HPO₄ – 0,5

После стерилизации среды в колбу вносят стерильный складчатый фильтр.

Приложение 2

Определение влажности почвы

В металлический или стеклянный бюкс, высушенный до постоянной массы, берут навеску почвы массой 5-10 г. Сушат почву до постоянной массы при температуре 105⁰С. Затем определяют массу высушенной почвы.

Влажность почвы рассчитывают как разность массы сырой и высушенной почвы, отнесенной к массе сырой почвы, выраженной в процентах.

Содержание абсолютно сухой почвы равно 100% - % влажности почвы.

ЛИТЕРАТУРА

Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.М. Горленко и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. – М.:Издательский центр «Академия», 2004.-272 с.

Кураков А.В., Ильинский В.В., Котелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях (ред. Садчиков А.П., Котелевцев С.В.). - М.: Издательство "Графикон", 2006. - 336 с. http://znanium.com/bookread.php?book=345097

Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. -М.: Наука, 2003.-348 с.

Чурбанова Н.Ф. Микробиология. М.:Наука.-1991.-189 с.

Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир.-1987.-567 с.

Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во МГУ.-1985.-376 с.

Структурно-функциональная роль почв и почвенной биоты в биосфере / Г.В. Добровольский, И.П. Бабьева, Л.Г. Богатырев и др. – М.: Наука, 2003.-364 с.

Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов.-М.: Дрофа, 2004.-256 с.

Марфенина О.Е. Микробиологические аспекты охраны почв. - Изд-во МГУ, 1991. 128с.

Звяинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. Изд-во МГУ, 2005.

Мишустин Е.Н. Микроорганизмы как компоненты биогеоценоза.- М.: Наука. -1984.-245 с.