Биодиагностика почв по ферментативной активности

Цель работы ‑ определение биологической активности почв на разном удалении от дороги по четырем ферментным системам: дегидрогеназам, каталазе, инвертазе, уреазе.

Основные понятия

Почвенно-энзимологические методы позволяют определять не количественное содержание ферментов в почве, а активность ферментов, находящихся преимущественно в адсорбированном (иммобилизованном) состоянии на поверхности почвенных коллоидов и частично в почвенном растворе.

Принципметода определения активности почвенных ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, рН среды и концентрации субстратов.

Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов, а также в почве. Наиболее распространены в почвах такие оксидо-редуктазы, как каталаза и дегидрогеназы, активность которых является важным показателем генезиса почв.

Каталазаразлагает на воду и молекулярный кислород ядовитую для клетки перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания живых организмов в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ.

Активность каталазы определяется газометрическим методом по объему выделившегося кислорода, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой.

Дегидрогеназы ‑ ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, отщепляя водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы переносят водород непосредственно на молекулярный кислород, другие - на какие-либо акцепторы, например на хиноны, метиленовую синь.

Для определения активности дегидрогеназы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазана (трифенилформазан (ТФФ).

Гидролазы осуществляют реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные амидные, пептидные и др. К этому классу относятся ферменты инвертаза, уреаза и др., активность которых является важным показателем биологической активности почв и широко используется для оценки антропогенного воздействия.

Инвертаза действует на p-фруктофуранозидную связь в сахарозе, рафинозе, стахиоэе и производит расщепление сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы.

Фотоколориметрическое определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.

Разложение органических азотистых соединений осуществляется при непосредственном участии внеклеточных ферментов. Образующийся при уреазной активности аммиак служит источником питания растений.

Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ. Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение; она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот.

Определение каталазной активности

Оборудование и реактивы:

Cистема для газометрии (рис. 8); 10%-й раствор Н₂O₂; СаСО_э.

Рис. 8 ‑ Установка для газометрического определения каталазной активности в почвенных образцах:

1 — колба, 2 — бюретка, 3 — переходник, 4 — груша с водой

Порядок выполнения работы

1. Навеску просеянной почвы 1 г внести в колбу на 100 см³, добавить 0,5 г СаСО₃.

2. На дно осторожно поставить с помощью пинцета маленький стаканчик с 1,7 см³ 10%-го раствора перекиси водорода.

3. Навеску почвы смочить 4 см³ дистиллированной воды.

4. Колбу плотно закрыть каучуковой пробкой с трубкой, соединенной с бюреткой толстостенным каучуком через тройник, снабженный зажимом. Бюретка сообщается с грушей. Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в них уравновешивают и грушу закрепляют на определенной высоте.

5. Начало опыта отметить по секундомеру в момент, когда сосудик с перекисью водорода опрокинут, и вслед за этим встряхнуть содержимое колбы. Взбалтывание смеси следует продолжать во все время опыта, не касаясь непосредственно дна колбы руками. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают.

6. Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают в течение 1 мин при температуре 18-20⁰С.

7. Активность каталазы выражают в объеме (см³) кислорода, выделившегося на 1 г почвы в минуту. Ошибка определения до 5%.

8. Аналогичные процедуры проделать со всеми образцами почв.

9. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв каталазой.

Таблица15 ‑Шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами

Степень обогашенности почв	Каталаза, О2 см3/г за 1 мин	Дегидрогеназы, мг ТФФ на 10 г за 24 ч	Инвертаза, мг глюкозы на 1 г за 24 ч	Уреаза, мг NH4, на 10 г за 24 ч	Фосфотаза, мг Р2О3 на 10 г за 1 ч
Очень бедная	< 1	<1	<5	<3	<0,5
Бедная	1-3	1-3	5-15	3-10	0,5-1,5
Средняя	3-10	3-10	15-50	10-30	1,5-5,0
Богатая	10-30	10-30	50-150	30-100	5-15
Очень богатая	>30	>30	> 150	> 100	> 15

Определение дегидрогиназной активности

Приборы, посуда, реактивы:

Фотоколориметр; миллиметровая бумага; 0,1М раствор глюкозы; 1 %-й раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ); СаСО₃; этиловый спирт; трифенилформазан (ТФФ).

Порядок выполнения работы

1. Навески воздушно-сухой почвы по 1 г из каждого образца поместить в пробирки, добавить по 10 мг (на кончике шпателя) СаСО₃, по 1 см³ 0,1 М раствора глюкозы и по 1 см³ 1%-го раствора ТТХ; содержимое каждой пробирки тщательно смешать.

2. Пробирки поместить в анаэростат и откачать воздух насосом при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин. Затем инкубировать при 30⁰С в течение 24 ч.

3. По истечении времени инкубации содержимое пробирок экстрагировать в 3-4 приема 25 см³ этилового спирта. Для этого небольшой объем спирта внести в пробирку и встряхивать в течение 5 мин до появления красной окраски. Дать отстояться и надпочвенную жидкость профильтровать через бумажный фильтр. Добавить в пробирку следующую порцию спирта.

4. Полученный окрашенный раствор формазана колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром (500-600 нм).

5. Количество формазана в миллиграммах рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор формазана в этиловом спирте в концентрации 0,1 мг в 1 см³. Рабочие растворы для составления кривой приготовить путем разведений стандартного раствора (примерно 5 точек). Стандартную кривую построить на миллиметровой бумаге в системе: оптическая плотность при длине волны 500-600 нм - концентрация формазана в спирте.

6. Вычислить активность дегидрогеназы. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв дегидрогеназой.

Обработка данных

Активность дегидрогеназы (X) выражают в миллиграммах ТФФ на 10 г почвы за сутки по формуле:

, (12)

где V ‑ общий объем фильтрата, 25 см³;

10 ‑ пересчетный коэффициент веса почвы, г;

v ‑ произведение объемов субстрата и реагента, 1 см³;

А ‑ количество ТФФ, полученное по калибровочной кривой, мг/см³. Ошибка определения ‑ до 8 %.

Определение инвертазной активности

Приборы, посуда, реактивы:

Фотоколориметр; 5%-й раствор сахарозы; ацетатный буфер (рН 4,7); толуол; раствор Феллинга: а ‑ 40 г CuSO₄×5Н₂О растворяют в воде и доводят до 1 дм³, фильтруют через бумажный фильтр, б ‑ 200 г сегнетовой соли (С₄H₄O₆KNa×4Н₂О) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН и доводят до 1 дм³

Порядок выполнения работы

1. В колбы вместимостью 50 см³ поместить по 5 г каждого образца почвы, добавить по 10 см³ 5%-го раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 5-6 капель толуола.

2. Колбы закрыть пробками, встряхнуть, поместить в термостат при температуре 30⁰С на 24 ч и периодически встряхивать их.

3. После инкубации содержимое колб отфильтровать в мерные колбы на 25 см³. Довести до метки.

4. Из фильтратов взять по 6 см³ в большие пробирки, добавить по 3 см³ раствора сегнетовой соли и 3 см³ раствора сернокислой меди, хорошо перемешать и кипятить на водяной бане 10 мин. Получается красный осадок.

5. Пробирки с раствором охладить в воде, содержимое отфильтровать в большие пробирки. Прозрачный фильтрат колориметрировать на ФЭК, используя светофильтр с длиной волны 630 нм, ширина кюветы 1 см.

6. Для получения калибровочной кривой приготовить стандартный раствор: 6 мг глюкозы в 1 см³. Разведением приготовить серию растворов. Фотоколориметрировать и построить кривую: оптическая плотность ‑ концентрация глюкозы в 1 см³.

7. Вычислить активность и по табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв инвертазой.

Обработка данных

Активность инвертазы (X) выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч по формуле:

X = , (13)

где А ‑ количество глюкозы, полученное по калибровочной кривой из оптической плотности, мг/см³;

m ‑ навеска почвы, 5 г;

V ‑ общий объем фильтрата, 25 см³;

v ‑ объем фильтрата, взятого для анализа, 6 см³.

Ошибка определения ‑ до 5 %.

Определение уреазной активности почв

Приборы, посуда, реактивы:

Фотоколориметр; 2%-й раствор мочевины в фосфатном буфере (рН = 6,7); 50%-й раствор сегнетовой соли; 50%-й раствор CCl₃COOH (трихлоруксусная кислота); 1%-й раствор КС1; реактив Несслера; стандартный раствор NH₄C1.

Порядок выполнения работы

1. По 5 г воздушно-сухой почвы поместить в колбы емкостью 100 см³, прилить по 20 см³ 2%-го раствора мочевины в фосфатном буфере (рН 6,7) и по 200 мкл толуола.

2. Колбы плотно закрыть и поместить в термостат при температуре 37⁰С на 4 ч.

3. После экспозиции прилить по 1 см³ 50%-го раствора трихлоруксусной кислоты.

4. Для вытеснения из почвы поглощенного аммиака добавить по 50 см³ 1 н. раствора хлористого калия.

5. Содержимое колб отфильтровать.

6. По 2 см³ фильтрата поместить в мерные колбы объемом 50 см³, развести водой до 30 см³, затем прилить по 2 см³ 50%-го раствора сегнетовой соли и по 2 см³ реактива Несслера. Колбы долить водой до метки, перемешать и окрашенный раствор колориметрировать при длине волны 400 нм.

7. Содержание аммиака в фильтрате рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор NH₄C1 в концентрации 0,005 мг N-NH₄ в 1 см³. Сделать серию разведений. Построить калибровочную кривую.

8. Вычисляют активность уреазы.

9. По табл. 15 оценить степень насыщения исследуемых почв уреазой.

Обработка данных

Активность уреазы (X) выражают в миллиграммах N-NH₄ на 1 г почвы за 4 ч по формуле:

X = , (14)

где А ‑ содержание аммиака в фильтрате, полученное по калибровочной кривой, мг/см³;

V ‑ общий объем фильтрата, 50 см³;

m — навеска почвы, 5 г.

Вопросы для самоподготовки:

1. Что такое каталазная активность?

2. Дайте оределение инвертазной активности.

3. Охарактеризуйте уреазную активность.

4. Что такое буферная смесь?

5. Принцип и сущность метода определения активности почвенных ферментов.

6. Методика отбора образцов почвы.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Таблица 1 ‑ Примерный список организмов - индикаторов сапробности

Организмы	Сапробность
Нитчатые бактерии:
Sphaerotilus natans	р
Beggiatoa sp.	р
Thiothrix sp.	р
Грибы:
Leptomitus lacteus	α
Mucor racemosus	α
Fusarium aquaeductum	р
Водоросли:
сине-зеленые:
Anabaena flos aquae	β
Microcystis aeruginosa	β
Aphanizomenon flos aquae	β
Oscillatorla tenuis	α
Диатомовые	-
Cymbella cesati	о
Oomphonema cevli	о
Melostra granulata	β
Navicula angustata	α
Navicula apiculata	α
Synedra acus	β
Synedra ulna	β
Nitzschia palea	α
эвгленовые:
Euglena acus	β
Euglena viridis	р
Euglena deses	α
зеленые и протококковые:
Volvox globator	о-β
Ankistrodesmus falcatus	β-α
Crucigenta rectangularis	а-β
Scenedesmus quadricauda	β
Draparnaldia sp.	о
Ulothrix zonata	о
Stlgeoclonium tenue	α
Животные:
амебы:
Pelornyxa palustris	р

Организмы	Сапробность
инфузории:
Colpidium, campylum	p
Colpldlum colpoda	p
Euplotes charon	β
Chllodon cucullulus	p
Opercularia coaretata	α
Paramecium caudatum	α
Spirostomum amblguum	α
Stentor coeruleus	α
Vortlcella convallarla	α
Vorticella microstoma	p
Podophrya fixa	α
коловратки:
Kellcottia longispina (syn. Notholca Iongispina)	о
Keratella cochlearls	β
Keratella quadrata	β
Leucane lunarls (syn. Monostyla lunarls)	β
Rotaria rotatoria (syn. Rotifer vulgaris)	α
олигохеты:
Limnodrilus hofmelsterl	p
Tub if ex tublfex	p
Stylarla lacustris	β
ракообразные:
Daplmla magna	α
Daphnla pulex	α
Leptodora Kindtli	о
Eudiaptomus gracilis	o
Astacus fluviatilis	o
насекомые:
Caenls macrura	o
Heptagenia coerulana	β
Chironomus Plumosus	р
рыбы:
лещ:	β
усач	β
форель	o
линь	β-α

Таблица 2 ‑ Шкала частот для пересчета организмов в 100 полях на частоту

Значение частоты	Микробентос	Обрастания
Данные подсчета	Сумма в 100 полях
1-я категория крупности
	Не более 1 в каждом 2-м поле зрения Не более 2 в поле зрения Не более 10 в поле зрения Не более 30 в поле зрения Не более 60 в поле зрения Более 60 в поле зрения	Не более 1 в каждом 2-м поле зрения Не более 2 в поле зрения Не более 10 в поле зрения Не более 50 в поле зрения Не более 250 в поле зрения Более 250 в поле зрения	1-50 50-200 200-1000 1000-5000 5000-25000 Более 25000
2-я категория крупности
	Не более 1 в каждом 20-м поле зрения Не более 1 в каждом 5-м поле зрения Не более 1 в поле зрения Не более 3 в поле зрения Не более 6 в поле зрения Более 6 в поле зрения	Не более 2 в 20 полях зрения Не более 1 в 5 поле зрения Не более 1 в поле зрения Не более 5 в поле зрения Не более 25 в поле зрения Более 25 в поле зрения	1-5 6-20 21-100 100-500 500-2500 Более 2500
3-я категория крупности
	1 в 100 полях зрения 1 в 50 полях зрения Не более 1 в 10 полях зрения Не более 1 в 4 полях зрения Не более 1 в 2 полях зрения Приблизительно 1 в поле зрения	1 в 100 полях зрения 1 в 50 полях зрения Не более 1 в 10 в полях зрения 1в2 полях зрения Не более 2 в поле зрения Более 2 в поле зрения	3-10 10-50 50-200 Более 200

Приложение

Таблица 13. Пересчет результатов количественного учета на значение частоты

Значение частоты, h	Зоопланктон	Макробентос
	Доля одного вида в общем количестве экземпляров:	Количество экземпляров на площади 0,1 м2 грунта водоема
	не более 1	1-5
		4-10
	4-10	11-50
	10-20	50-150
	20-40	150-500
	40-100	Свыше 500
Зона	Условное обозначение	Численное значение	Зона	Условное обозначение	Численное значение
Олиго-сапробная	o		Альфа -мезосапробная	α
Бета-мезосапробная	β		Полисапробная	p

Приложение

Пример вычисления сапробности

Проба: река ниже города. Дата ________________ Сообщество: обрастания.

Организмы	s	h	sft
Euglena viridis	p
Scenedesmus acuminatus	β
Spirogyra sygmoidea	β
Closterium acerosum	α
Closterium moniliierum	β
Cyclotella menengiana	α
Cymbella vesiculosa	β
Diatoma vulgare	β
Melosira italica	β
Melosira varians	β
Navicula cryptocephala	α
Navicula viridua	α
Nitzschia acicularis	β
Nitzschia palea	α
Surirella ovata	β
Chilidonella cuculata	α
Colpoda cuculus	α
		Sh=41	S(sh)=103

Sh_p=3; Sh_α=15; Sh_β=23.

S=S(sh)/(Sh)-103/41=2,51/

Вычисление погрешности:

Интервал точности для статистической надежности 95%.

S=s±t_0,05s_S=2,51±2,02×0,1;

S=2,51±0,2.