Жидкостная хроматография

Газовая хроматография (ГХ) - хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара - инертный газ (водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ).

ГАЗЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ХРОМАТОГРАФИИ:

В качестве подвижной фазы в газовой хроматографии используются, как правило, легкие инертные газы (азот, гелий, водород, воздух, аргон и др.), которые практически нерастворимы в НЖФ (ГЖХ) или практически несорбируются адсорбентом и выполняют при обычных давлениях только транспортные функции, различаясь лишь вязкостью и коэффициентом диффузии сорбатов в газе-носителе.

В подавляющем большинстве случаев применяются газы, сжатые до давления 15 МПа и содержащиеся в баллонах емкостью 40 л. В случаях, когда невозможно или трудно транспортировать стальные баллоны с газами, применяются электролитические или химические генераторы водорода, кислорода, углекислого газа и др. Если в качестве газа-носителя необходимо использовать водяной пар, то его следует получать кипячением дистиллированной воды при заданной температуре непосредственно в приборе.

Аргон обычно поставляют достаточно чистым, и поэтому он не нуждается в дополнительной очистке. Применять аргон в качестве газа-носителя выгодно, поскольку он не взрывоопасен и сравнительно дешев.

Ламповый азот, применяемый в хроматографии, имеет степень чистоты, равную 99,99% поэтому он также не нуждается в дополнительной очистке. То же относится и к гелию: в случае использования детектора по теплопроводности или пламенно-ионизационного детектора этот газ не нужно дополнительно очищать. Однако в случае применения гелиевого ионизационного детектора газ не должен содержать даже следов примесей.

Электролитический водород удобен для хроматографии и также поставляется в баллонах или генерируется непосредственно в лабораторном электролизере. Степень его чистоты обычно равна 99.8%, что вполне достаточно для рутинной работы. При более высоких требованиях, предъявляемых к чистоте, водород необходимо освобождать от остатков кислорода и от влаги. Из-за очень низкой вязкости водорода перед началом работы необходимо проверить все соединения и полностью устранить все неплотности. В качестве газа-носителя водород рекомендуется применять до температуры 250° С, а в случае работы при более высоких температурах этот газ лучше заменить гелием.

Что касается вспомогательных газов, то кислород и воздух обычно подвергают дополнительной сушке; если воздух отбирается из компрессора, то на его пути устанавливают еще и фильтр для улавливания компрессорного масла. Технический углекислый газ также содержит большое количество масла, а иногда и следы метана.

Очистка газов

Применяемые газы содержат примеси в ничтожно малых концентрациях. Присутствие этих примесей чаще всего не влияет на процесс разделения, однако, они оказывают вредное действие на неподвижную фазу, находящуюся в колонке. Кислород и водяной пар при температурах выше 100°С разлагают полигликоли, полиэфиры и некоторые силиконовые фазы, что приводит к изменению термостойкости и хроматографических свойств неподвижных фаз. Органические примеси даже в ничтожно малых концентрациях вносят искажения при проведении анализа с программированием температуры. На стадии охлаждения колонки эти вещества накапливаются в ее начале и по мере повышения температуры мигрируют к ее концу. Иногда эти примеси могут выходить с анализируемыми компонентами и при пониженных концентрациях последних даже маскировать их. Поэтому все примеси рекомендуется удалять из применяемых газов физическими или химическими методами.

К первой группе этих методов относится адсорбция и конденсация при низких температурах или их комбинация. Для этой цели подходят все адсорбенты с большой удельной поверхностью, такие, как активированный уголь, силикагель и молекулярные сита. При достаточном снижении температуры (до -80 − -190°С) происходит интенсивная адсорбция или капиллярная конденсация примесей. Однако уровень хладагента необходимо постоянно поддерживать на одинаковой высоте, поскольку колебания уровня вызывают изменение давления и потока очищенного газа. Перед загрузкой в линию очистки адсорбенты следует активировать нагреванием, по крайней мере, до 350°С.

Для осушки и испарения кислых примесей (СО2, SO2) в настоящее время применяют молекулярные сита. Они обладают большой емкостью (до 30% от собственной массы), способностью адсорбировать воду даже при температурах выше температуры ее кипения и легко регенерируются.

Для осушения и задерживания следов органических примесей подходят все типы молекулярных сит, применяемых в хроматографии (5А, 10Х, 13Х), а для удаления только воды хорошо зарекомендовали себя молекулярные сита 3А и 4А с диаметром пор менее 0,4 нм.

Кислород, водород, углекислый и ряд других газов обычно удаляют химическими методами. Наиболее подходящими для этой цели являются каталитические реакции, протекающие в условиях умеренных температур. Для снижения содержания кислорода в водороде или в газах, содержащих водород, рекомендуется использовать палладиевый катализатор, работающий уже при комнатной температуре. Образующаяся при этом вода улавливается молекулярным ситом. Для удаления кислорода из газов, не содержащих водород, необходимо либо добавлять водород, либо применять медный, марганцевый или никелевый катализаторы, для которых оптимальная рабочая температура составляет 20−100°С. Диоксид углерода, метан и другие углеводороды, содержащиеся в виде следов, удаляют на медном или никелевом катализаторе в оксидной форме, нагреванием до 600°С.

Выбор газа-носителя

Установлено, что использование в качестве газа-носителя азота и аргона более предпочтительно, однако можно применять и гелий, хотя чувствительность при этом, как правило, ниже. Именно в этих газах энергия электронов изменяется в широких пределах, что обеспечивает благоприятные условия для их захвата различными электроноакцепторными веществами.

Природа газа-носителя влияет на чувствительность детектирования: во-первых, в разных газах при неизменных условиях хроматографирования различна энергия и подвижность электронов, а, следовательно, и вероятность захвата неодинакова. Во-вторых, в разных газах различна подвижность ионов, а, следовательно, и скорость процессов рекомбинации. В-третьих, радиоактивное излучение проникает в разных газах на различное расстояние, т.е. поглощение излучения и ионизация будут различны.

Источник газа-носителя:

Чаще всего это — баллон со сжатым или сжиженным газом, который обычно находится под большим давлением (до 150 атмосфер). Чаще всего при хроматографии используют гелий, реже азот, ещё реже водород и другие газы.

В России принята цветовая маркировка баллонов, содержащих различные газы.

Газ	Окраска баллона	Цвет надписи с названием газа
Азот	Чёрный	Жёлтый
Водород	Тёмно-зелёный	Красный
Гелий	Коричневый	Белый
Аргон (техн.)	Чёрный	Синий
Аргон (чист.)	Серый	Зелёный
Кислород	Голубой	Чёрный
Горючие газы	Красный	Белый

Этот метод можно использовать для анализа газообразных, жидких и твёрдых веществ с молекулярной массой меньше 400, которые должны удовлетворять определённым требованиям, главные из которых — летучесть, термостабильность, инертность, лёгкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому газовую хроматографию широко используют как серийный метод анализа органических соединений.

· паровая хроматография (газ-носитель – пары органических и неорганических веществ (например, вода) при температурах ниже критических и небольших давлениях. Роль подвижной фазы сводится к модифицированию сорбента. Используют также добавки к обычным газам-носителям с целью получения более симметричных пиков полярных сорбатов.

· сверхкритическая флюидная хроматография(СКФХ) – применение в качестве подвижных фаз различных веществ при температурах и давлениях больше критических. Элюент в этом случае обладает высокой растворяющей способностью, что позволяет увеличить летучесть исследуемых веществ на 3–4 порядка по сравнению с обычными условиями. Сверхкритическим флюидом (СКФ) — называют состояние вещества, при котором исчезает различие между жидкой и газовой фазой. Любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки является сверхкритическим флюидом. Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. Так, СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. Вещества в сверхкритическом состоянии могут применяться в качестве заменителей органических растворителей в лабораторных и промышленных процессах. Наибольший интерес и распространение в связи с определенными свойствами получили сверхкритическая вода и сверхкритический диоксид углерода.

Рис. 1. Фазовая диагармма двуокиси углерода.

В Таблице приведены критические параметры и молярная масса для практически наиболее применимых веществ.

Таблица 1. Критические параметры различных растворителей
Растворитель	Молекулярная масса	Критическая температура, Tкрит	Критическое давление, Pкрит	Критическая плотность, ρкрит
г/моль	K	МПа (атм.)	г/см3
Диоксид углерода(CO2)	44.01	303.9	7.38 (72.8)	0.468
Вода (H2O)	18.015	647.096	22.064 (217.755)	0.322
Метан (CH4)	16.04	190.4	4.60 (45.4)	0.162
Этан (C2H6)	30.07	305.3	4.87 (48.1)	0.203
Пропан (C3H8)	44.09	369.8	4.25 (41.9)	0.217
Этилен (C2H4)	28.05	282.4	5.04 (49.7)	0.215
Пропилен (C3H6)	42.08	364.9	4.60 (45.4)	0.232
Метанол (CH3OH)	32.04	512.6	8.09 (79.8)	0.272
Этанол (C2H5OH)	46.07	513.9	6.14 (60.6)	0.276
Ацетон (C3H6O)	58.08	508.1	4.70 (46.4)	0.278
Аммиак (NH3)	17.03	405.3	11.35 (115.7)	0.322
Ксенон (Xe)	131.29	289.5	5.84 (58.4)	1.110

Одно из наиболее важных свойств сверхкритического состояния - это способность к растворению веществ. Изменяя температуру или давления флюида можно менять его свойства в широком диапазоне. Так, можно получить флюид, по свойствам близкий либо к жидкости, либо к газу. Так, растворяющая способность флюида увеличивается с увеличением плотности (при постоянной температуре). Поскольку плотность возрастает при увеличении давления, то меняя давление можно влиять на растворяющую способность флюида (при постоянной температуре). В случае с температурой завистимость свойств флюида несколько более сложная - при постоянной плотности растворяющая способность флюида также возрастает, однако вблизи критической точки незначительное увеличение температуры может привести к резкому падению плотности, и, соответственно, растворяющей способности.

Сверхкритические флюиды неограниченно смешиваются друг с другом, поэтому при достижении критической точки смеси система всегда будет однофазной. Приблизительная критическая температура бинарной смеси может быть рассчитана как среднее арифмитическое от критических параметров веществ
Tc(mix) = (мольная доля A) x TcA + (мольная доля B) x TcB.
Если необходима большая точность, то критические параметры могут быть рассчитаны с использованием уравнений состояния, например с помощью уравнения Пенга-Робинсона.

Уникальная способность сверхкритического флюида растворять большие объемы газа, в особенности H2 и N2, в купе с высоким коэффициентом диффузии, делает его использование в качестве растворителя химических реакций его чрезвычайно перспективным. Изменение температуры и давления позволяют влиять на свойства растворителя и маршрут реакции, что делает возможным более высокие выходы целевого продукта. Также следует заметить что использование CO₂ абсолютно экологично.

· плотностная хроматография. Здесь элюентами служат газы при давлениях до 1,0÷2,0 тыс. атм. Это позволяет вызвать движение по колонке веществ с молекулярными массами до 400 000 (повышение летучести приблизительно на 6 порядков).

Рассмотренные варианты хроматографии предусматривают повышение

плотности подвижной фазы от газа до жидкости и являются промежуточными между газовой и жидкостной хроматографией.

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография - способ (метод) хроматографического разделения в котором подвижной фазой является жидкость и разделяемые вещества находятся в постоянном равновесии между подвижной и неподвижной фазой.

Роль подвижной фазы (растворителя) в жидкостной хроматографии весьма многообразна. Наряду с транспортной функцией растворитель активно участвует в самом процессе разделения и оказывает существенное влияние на возможности детектирования. Часто незначительное изменение состава подвижной фазы дает возможность оптимизировать процесс, улучшить форму пиков, разрешение отдельных компонентов и даже изменить механизм разделения. Поэтому при выборе растворителей необходимо учитывать весь комплекс их свойств, в той или иной степени влияющих на проведение хроматографического эксперимента.

ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К РАСТВОРИТЕЛЯМ:

Растворители должны удовлетворять следующим основным требованиям:

a) чистота

b) химическая инертность

c) совместимость с детектором

d) достаточная растворяющая способность по отношению к анализируемым веществам

e) низкая вязкость

f) безопасность

g) доступность

В некоторых случаях существенное значение имеют:

a) смешиваемость с другими растворителями,

b) температура кипения и возможность легкого извлечения вещества из элюата.

Чистота растворителя в жидкостной хроматографии имеет очень большое значение, так как различные примеси в подвижной фазе влияют на все основные стадии процесса: подачу растворителя, разделение в колонке, детектирование и воспроизводимость результатов. Требуемая степень чистоты растворителя определяется выбранным вариантом разделения и используемой аппаратурой. Наличие примесей в растворителе может вызвать следующие типичные затруднения.

ЭЛЮИРУЮЩАЯ СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ И ЭЛЮОТРОПНЫЕ РЯДЫ:

Взаимодействие растворителя с растворенным веществом определяется комплексом четырех основных типов межмолекулярных взаимодействий:

a) дисперсионного

b) индукционного

c) донорно-акцепторного (включая образование водородной связи)

d) диэлектрического (сольватация ионов).

Суммарный эффект всех типов взаимодействий определяет полярность растворителя, а преимущественное проявление какого-либо из них — его селективность. В процессе развития жидкостной распределительной хроматографии предлагались различные способы оценки относительной полярности растворителей. В качестве меры полярности, принят параметр Р’, который позволяет заметно надежнее оценивать относительную активность растворителей, чем широко используемый ранее параметр растворимости Гильдебранда. Полярность растворителя определяет его элюирующую силу: в адсорбционной и нормально-фазной распределительной хроматографии с увеличением полярности элюирующая сила растворителя возрастает, а в обращенно-фазной — снижается. Чем больше элюирующая сила подвижной фазы, тем меньше коэффициент емкости для данного вещества на данном сорбенте. Расположение растворителей в соответствии с возрастанием их элюирующей силы называют элюотропным рядом. В адсорбционной хроматографии общепринятым является элюотропный ряд Снайдера. Растворители расположены в соответствии с этим рядом. Мерой элюирующей силы растворителя служит величина ε°, экспериментально определенная для ряда растворителей на оксиде алюминия в сравнении с n-пентаном (ε°=0). Величина ε° пропорциональна разности удельных энергий взаимодействий растворителя и пентана с чистой поверхностью адсорбента. Для силикагеля значения ε° в среднем в 1,25 раза ниже, чем для оксида алюминия.

Элюотропные серии для адсорбционной хроматографии на силикагеле:

ε° I II III

0,00 Пентан Пентан Пентан

0,05 Изопропилхлорид Дихлорэтан(3%) — Бензол (4%) — пентан

(4,2%) —пентан Пентан

0,10 Изопропилхлорид Дихлорэтан(7%) — Бензол (11%) — пентан

(10%) —пентан пентан

0,15 Изопропилхлорид Дихлорэтан(14%) — Бензол (26%) — пентан

(21 %) — пентан пентан

0,20 Эфир (4%) —пентан Дихлорэтан(26%) — Этилацетат(4%) —

Пентан пентан

0.25 Эфир (11%) — Дихлорэтан(50%) — Этилацетат(11%)—

пентан пентан пентан

0,30 Эфир (23%) — Дихлорэтан(82%) — Этилацетат (23%) —

пентан пентан пентан

0,35 Эфир (56%) — Ацетонитрил (3 %) — Этилацетат (56%) —

пентан бензол пентан

0,40 Метанол (2 %) — Ацетонитрил (11%) —

эфир бензол

0.45 Метанол (4%) — Ацетонитрил (31 %)—

эфир бензол

0,50 Метанол (8%) — Ацетонитрил

эфир 0,55 Метанол (20%) —

эфир 0,60 Метанол (50%) —

Примечание. Указано содержание сильного растворителя (в % об.), в элюенте.

Выведенный элюотропный ряд справедлив для всех сорбентов оксидного типа и, в общем случае, практически совпадает с рядом, построенным по возрастанию диэлектрической проницаемости растворителей. Для адсорбционной хроматографии разработаны также элюотропные серии (I—III), представляющие собой смеси растворителей с постепенно возрастающей элюирующей силой. Влияние элюирующей силы растворителя на k' ориентировочно можно оценить по следующим соотношениям: k' изменяется в 2,2—3 раза при измерении Р' на единицу (распределительная хроматография) и в 3—4 раза—при изменении ε° на 0,05 (адсорбционная хроматография).

СЕЛЕКТИВНОСТЬ РАСТВОРИТЕЛЯ:

При анализе многокомпонентных смесей, содержащих соединения различной химической природы, часто наблюдается перекрывание некоторых тиков. Наилучшим способом оптимизации разделения в этом случае является изменение селективности подвижной фазы при той же самой элюирующей силе. Селективность растворителей определяется соотношением вкладов различных типов межмолекулярных взаимодействий в системе растворитель — вещество. На предложенной Снайдером треугольной диаграмме растворители разбиты на восемь групп, различающихся по типу селективности.

Крайние группы: I, II, V и VIII имеют наиболее ярко выраженную селективность: в группу I ходят акцепторы протонов (простые эфиры, амины), в группу VIII—доноры протонов (хлороформ, вода, м-крезол), в группу II—доноры-акцепторы (спирты) и в группу V—растворители, предпочтительно взаимодействующие с веществами, имеющими большой дипольный момент (метиленхлорид, дихлорэтан), Растворители группы VII (ароматические соединения, нитроалканы) характеризуются повышенным взаимодействием с акцепторами электронов. Принадлежность растворителя к определенной группе также указана в приложении 2.

Группы селективности растворителей:

Xe— протоноакцепторные свойства;

Xd— протонодонорные свойства;

Хn— дипольвое взаимодействие

Селективность подвижной фазы изменяют путем замены растворителя В, использованного для получения необходимой элюирующей силы, на растворитель, относящийся к другой группе, и подбора такой его концентрации, которая обеспечивал бы ту же элюирующую силу подвижной фазы. В различных видах жидкостной хроматографии решение этой задачи имеет свои специфические особенности, рассмотренные в соответствующих разделах.