Преимущества некоторых белковых препаратов, получаемых методом генетической инженерии
Основное преимущество – невозможность перекрестного инфицирования при введении лекарственного препарата.
Интерферон – видоспецифическое белковое вещество, синтезируемое лейкоцитами в ответ на воздействие интерферонов. Лейкоциты и другие клетки млекопитающих, в частности, при заражении вирусами, продуцируют не один интерферон, а больше, объединяемых в семейство интерферонов, ингибирующих продуктивный цикл репликации вирусов. Вот почему они являются оружием первой линии защиты против вирусной инфекции. Однако в обычных клетках интерфероны не выявляются. Размеры молекул интерферонов близки по числу аминокислот, по молекулярной массе, но по другим признакам они различны: интерфероны b и γ являются гликопротеинами, интерферон a – протеином.
Интерфероны – клеточные белки и поэтому они видоспецифичны, т.е. каждому виду животного свойственен свой интерферон, но они не являются вирусоспецифическими.
Человеческие интерфероны a и b продуцируются преимущественно лейкоцитами, b – лимфобластами и соединительнотканными клетками мезенхимного происхождения – фибробластами в ответ на вирусную инфекцию. Интерферон γ образуется несенсибилизированными лимфоидными клетками Т-лимфоцитов в ответ на мутогены, и синсебилизированными лимфоцитами при стимуляции специфическими антигенами.
Интерферон a выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном ценрифугировании свежевыделенной крови человека. Из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т.е. 1 дозу для инъекции.
Из лимфобластных клеток получают лимфобластный интерферон. Методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата.
На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. Синтезированный генноинженерным способом интерферон по физико-химическим свойствам близок к интерферонам, полученным из крови доноров. Можно получить до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 104 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит количество интерферона, которое можно получить из 1 л крови доноров. Были получены штаммы бактерий, продуцирующие различные интерфероны: a, b, γ-типов.
Недостаточное использование Е. Coli для получения b и γ интерферонов – отсутствие в бактерии аппарата гликозилирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликозилированных молекул, хотя роль гликозилирования неясна и негликозилированные b и γ-интерфероны практически полностью сохраняют противовирусную активность. Эта особенность диктует осторожный подход к использованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике.
Следующий белковый препарат, получаемый методом генетической инженерии – соматотропин (или гормон роста человека); секретируется передней долей гипофиза. Это видоспецифический белок, состоящий из 191 аминокислотного остатка, молекулярная масса 22000. В клинике можно применять гормон роста человека из-за видоспецифичности. Получают из передней доли гипофиза трупов
К билету № 28.
В условиях биотехнологических исследований при поиске новых лекарственных средств:
1. Укажите отличие скрининга «Направленного» и «Ненаправленного».
2. Дайте описание скрининга и ее стадии, применительно к антибиотическим веществам.
При ненаправленном скрининге проводят тотальную проверку всех веществ, продуцируемых микроорганизмами на их антибиотическую активность. При направленном скрининге вещества целенаправленно ищут вещества с заранее заданными фармакологическими свойствами. Синтез новых структур с предполагаемой активностью чаще всего проводит в том классе соединений, где уже найдены вещества, обладающие нужной активностью. Выбирают нужный «скелет» основу будущего вещества.
Далее к избранному основному скелету вещества добавляют различные радикалами, которые будут способствовать растворению вещества в липидах и воде. Синтезируемую структуру целесообразно сделать растворимой одновременно в воде и жирах с той целью, чтобы она могла всосаться в кровь, перейти из него через гемато-тканевые барьеры в органы и затем вступить в связь с клеточными мембранами или проникнуть них внутрь клетки и соединиться с биомолекулами.
В таблице 1 представлены наиболее часто встречающиеся в лекарственных веществах радикалы и их средство к воде и липоидам.
Атомные группировки (радикалы), расположенные в порядке уменьшения их к воде, которые участвуют в жизнедеятельности организма медиаторы, витамины, гормоны или являются не заменимыми участниками биохимических процессов.
Гидрофильные группы
При синтезе новых лекарственных веществ необходимо иметь в виду, что их фармакологическая активность определяется не только размерами и формой молекулы, но и стерическими факторами, которые влияют на положение молекулы в пространстве.
Целенаправленный синтез лекарственных решений становится удачным, когда удастся найти такую структуру, которая по размеру, форме, пространственному положению электронно-протонным свойствам и ряду других физико-химических показателей будет адекватно живой структуре, подлежащей регулированию.
Это положение вытекает как из опыта изыскания синтетических средств, так и из закономерностей построения живых клеток.
В клетках теплокровных протекает свыше 2 тыс. биохимических процессов, которые поддерживают многообразие физиологической деятельности клеток. Удивительно сложная и специфическая деятельность клеток возможна благодаря связи между структурой внутриклеточных образований и их функций. Поэтому задача целенаправленного синтеза лекарств сводится к построению такого ключа, который будет открывать или закрывать главный или добавочный замок в биохимическом или биофизическом клеточном процессе, обусловливающем данную физиологическую функцию клетки.
Целенаправленный синтез веществ преследует не только практическую цель – получение новых лекарственных веществ с нужными фармакологическими и биологическими свойствами, но он также является одним из методов познания общих и частных закономерностей жизненных процессов.
Для построения теоретических обобщений необходимо дальнейшее изучение всех физико-химических характеристик молекул и выяснение решающих применений в ее структуре, обусловливающих переход от одного вида активности к другой.
Эти данные будут играть фундаментальную роль в построении научной теории целенаправленного синтеза новых лекарственных средств и установление физико-химических механизмов их взаимодействия с патологическими и нормально протекающими процессами в организме.
При получении антибиотиков синтезируется оба вида скрининга. Сначала выделяют новое вещество или синтезируют его. Затем изучают его активность и другие биологические свойства, определяют его дозировку.
Затем только препарат получают путевку в жизнь.
Вносят мутант Psendomonas melanogenuem и метиловый эфир Dl-фенилглицина. Условия процесса измельчают таким образом, чтобы они его свойствами образованию ампицилина. В роли катализатора выступает ацилаза, образуемая вторым мутантным организмом, которая не способная в этих условиях гидролизовать или синтезировать бензилпенициллин. В ходе этого двухстадийного процесса образуется только ампицилин.
ëД-(-) - l-аминобензилпенициллинù
В клинике широко применяются аминогликозидные антибиотики (стрептомицин, неомицин, канамицин, интамицин).
Бактерии, способные их анактивировать, были выделены не только от больных, но и как самостоятельные, образующие антибиотики штаммы. Их ферментативная активность может быть частью механизма детоксикации, при помощи которого организма - продуцент замещают себе от неблагоприятного воздействия образуемых или же веществ.
К числу модификаций происходящих при инактивации антибиотиков, относятся – ацетилирование. О –деформирование, О-аденимерование, О –нуклеотидилирование.
Установление механизма модификации позволило планировать и осуществлять химический синтез новых аналогов, устойчивых к такой инактивации.
Инактивация антибиотиков по другому механизму, включая гидролиз, гидроксилирование, эпоксидирование, сульфоокисление, форфорилирование или восстановление, обычно, приводит к образованию или полностью, или частично неоактивных производных. Их изучение позволит синтезировать новые аналоги выявить те участки молекул, которые ответственны за антибиотическую активность, а также создать рациональные основы «конструирования» антибиотиков и усовершенствования производства.
Пенициллиназы гидролизуют b- лактатное кольццо молекул субстрата и является основой устойчивости болезнетворных бактерий к перициллинам и цефалоспоринам.
В результате гидролиза амидной связи кольца образуется пенициллиновая кислота (см. ниже) которая полностью лишена антимикробной активности. Эти ферменты синтезируются многими бактериями, они могут различаться по строению и специфичности.
Гидролиз цефалоспорина ее глубокое изучение механизмов их действия позволило наладить производство устойчивых аналогов антибиотиков, таких как ампициллин и карбенициллин, также найти природные ингибиторы лактамазы клаваулановую и оливановую кислоты. b- лактамазы используются для оценки еоличества пенициламинов в пищевых продуктах и биологическое сырье, а также для инактивации пенициллина в молоке, что предотвращает аллергические реакции у его потребителей.
В некоторых случаях получать полезные предшественники с помощью микробов не удается. Так, при выработке цифалоспарина в основном образуется цифалоспорин С, который приходится затем химическим методом гидролизовать до 7- аминоцеофалоспороновой кислоты (см. рис. гидролиз цеофалоспорина С) и уже использовать как субстрат для получения новых полусинтетических цеофалоспоринов.
К билету №29
Объекты биотехнологии.
Основу любой биотехнологии, будь то биологическая очистка сточных вод, получение биогаза, извлечение с помощью микроорганизмов ценных металлов из бедных руд или же производство лекарственных, профилактических и диагностических препаратов, составляет использование биообъектов. Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы-микромицеты и макромицеты, протозойные микроорганизмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционально сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, пектины, нуклеиновые кислоты и др.).
В современной фармпромышленности используется очень широкий ассортимент биообъектов, группировка которых весьма сложна и наиболее рационально может быть выполнена на основе принципа их соразмерности. Биообъекты, объединенные в пять основных групп, причем, соразмерность в первых четырех имеет кратность в три порядка и только и пятой группе собраны биообъекты, отличающиеся по размерам от таковых предшествующей (четвертой) группы всего на один порядок.
Биообъекты, используемые при биотехнологических способах производства лекарственных (диагностических, лечебных и профилактических) средств:
Размер от 10 м до 1 см: доноры: человек, корова, лошадь и др.; микроорганизмы; - растения-бионапонители сапонинов, алкалоидов и т.д.; ядовитые животные и растения.
Размер от 1 см до 1 мм: гигантские водоросли, продуценты альгинатов (загусти гели, радиопротекторы); каллусные культуры меристемы (продуценты панаксозидов, биорансформаторы дигигоксииа и др.) - культуры тканей - дермы (искусственная кожа) - культуры клеток - лейкоцитов, продуцентов интерферонов
Размер от 1 мм до 1 мкм: клетки эукариот в культуре; клетки низших эукариот (плесени, дрожжей) и прокариот и культуре; биопродуценты; биотрансформаторы.
Размер от 1 мкм до 1 нм: бактериофаги; вирусы; Липосомы.
Размер менее 1 мкм: информационные макромолекулы (ДНК) макромолекулы с ферментативной активностью (ферменты-биокатализаторы, индивидуальные и мультиферментные комплексы); макромолекулы-носители.
В связи с приведенной классификацией биообъектов биотехнологию можно подразделить на микробиотехнологию, фитобиотехиологию и зообиотехнологию.
Как видно из данных, приведенных и таблице 2, наибольшее число реализованных процессов имеет место в микробной биотехнологии. Это объясняется тем, что многие микроорганизмы обладают заметным преимуществом перед растительными и животными объектами по таким показателям, как скорость размножения, лабильность и быстрота адаптации к изменяющимся условиям среды обитания.
К занятию № 30
В условиях биотехнологических исследований при поиске новых лекарственных средств:
1) Укажите отличие геномики от молекулярной генетики.
2) Дайте описание международного проекта «Геном человека и укажите его цель».
Молекулярная генетика – наука о закономерностях наследственности и изменчивости. Наследственность и изменчивость реализуются в процессе наследия, т.е. при передаче генетической информации от родителей к потомкам через половые клетки, или через соматические клетки. Генетика решает следующие задачи: изучает способы хранения информации и ее материальные носители; анализирует способы передачи наследственной информации; выявляет механизмы реализации генетической информации в процессе развития и влияние на них условий обитания; изучает механизмы изменчивости и ее роль в приспособительных реакциях и в эволюционном процессе; изыскивает способы исправления поврежденной генетической информации.
Прикладная генетика на основе вышеуказанного занимается селекцией растений и животных, медико-генетическими исследованиями для предотвращения рождения больных людей.
Геномика – научно-практическое направление молекулярной биологии, имеющее целью определение нуклеотидных последовательностей молекул ДНК. Геномика открывает доступ к диагностике генных и тяжелых соматических патологических состояний (астма, диабет и р.).
Программа «Геном человека».
Геном – совокупность наследственного материала, заключенного в гаплоидном наборе хромосом клеток данного вида организмов. Геном видеоспецифичен, так как представляет необходимый набор генов, который обеспечивает формирование видовых характеристик организмов в ходе их нормального онтогенеза.
Та часть программы «Геном человека», которая выполняется в США, включает следующие годпрограммы: построение генетических и физических карт с высоким разрешением; снижение себестоимости и повышение эффективност секвенирования ДНК.
Некоторые из намеченных на период 1990-1995 г.г. задач той части HGP, которая выполняется в США, в 1993 г. были пересмотрены. К 1996 г. удалось решить несколько вновь поставленных задач. Например, в 1994 г. была опубликована карта генетического сцепления человека, которая содержала 5826 локусов, охватывающих 4000 сМ. Хотя только для 908 локусов шансы сцепления составили больше 1000:1, конечная плотность маркеров равнялась 0,7 сМ, что больше ожидаемой в 1995 г. плотности карты 2-5 сМ. Однако уже в 1995 г. была построена полная физическая карта с разрешением 200 т.п.н.
С самого начала своего существования HGP должна была решать этические, правовые и социальные проблемы, связанные с картированием и секвенированием генома человека, вырабатывать стратегию, тактику и рарабатывать законопроекты, гарантирующие ответственное использование информации по генетике человека.
На основе этой программы были сформулированы пять основных принципов, которыми следует руководствоваться при использовании генетической информации и в рабочие генетических консультаций: право на автономию, конфиденциальность, справедливость, беспристрастность и качество. Генетическое тестирование должно проводиться добровольно после того, как пациент в достаточной степени информирован; тестированию должны подвергаться лишь лица, относящиеся к группе риска, тестируемые должны сами решать, будут ли они знакомиться с результатами теста.
К билету № 31.
В условиях биотехнологического производства лекарственных средств:
1. Приведите метод получения рекомбинантного инсулина.
2. Опишите способы контроля его концентрации в крови.
Рекомбинация - это любой процесс, способный привести к возникновению клеток или организма с двумя или более наследственными детерминантами, по которым их родители различались между собой, но которые соединены новым способом.
Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами.
Ген – участок ДНК, несущий определенную наследственную информацию.
Инсулин – это пептидный гормон, который состоит из двух пептидных цепей. Цепь А – 21 аминокислотных остатков, цепь Б-30 аминокислотных остатков. Цепи связаны двумя дисульфидными связями между остатками цистеина. Цепь А имеет дополнительную дисульфидную внутреннюю связь. Они обеспечивают пространственную структуру.
Существует способ получения рекомбинантного инсулина через двухцепочечный инсулин. На первом этапе воссоздают последовательность ДНК по аминокислотной последовательности и инсулина (получают чужеродную ДНК). Синтезируют отдельно цепь А и цепь Б, т.е. получают отдельно-синтезирующиеся гены. Каждый ген встраивают в b-галактолидазу плазмид. Клетки Е.coli выращивают на среде с галактозой и в них индуцируется синтез b- галактолидазы. В клетках Eхcoli происходит дальнейший синтез А и Б цепей. Полученную культуру обрабатывают бромцианом, который расщепляет белки по остатку цистеина. Затем синтезированные цепи отделяют от b- галактоциназы, очищают и объединяют. В результате получают нативный двухцепочечный инсулин не содержащий белков, токсинов, пирогенных веществ. Полученный инсулин не отличается по своим физическим свойствам от инсулина человека и приобретает гипогликемическую активность.
Существует другой способ получения рекомбинантного инсулина. Сначала синтезируют ген предшественников инсулина, вводят в плазмиды E. coli и получают проинсулин. Подвергают полученный проинсулин очистки, расщепляют трипетидами и получают нативный инсулин.
На рисунке приведена схема получения рекомбинантного инсулина путем введения гена человека, индуцирующего синтез инсулина, в плазмиду E. coli и клонирование гена в клетках кишечной палочки.
В соответствии с требованиями ГФ XI издания, активность испытуемого препарата инсулина определяют путем сопоставлением его гипогликемического (сахаропонижающего) действия с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина. За стандартный образец принимают препарат высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем многократного сопоставления с активностью международного стандарта и составляет не менее 25ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД) принимают специфическую активность количества массы стандартного образца, эквивалентного биологическому действию 1 международной единице действия инсулина.
Определение биологической активности инсулина проводят на здоровых кроликах массой 2,5-3,5кг. Определяют чувствительность кроликов к инсулину с этой целью кроликам после 18 часов голодания вводят подкожно раствор стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела животного. Процедуру проделывают дважды с интервалом 7-8 суток. Определяют величину снижения концентрации сахара в крови. Кровь для исследования берут из краевой вены уха + животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 часа после введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из двух определений после введения инсулина). Далее после обработки результатов исследования через 7-8 суток проводят определение биологической активности инсулина.
Кроликов после 18 часов голодания разделяют на две группы (после предварительного отбора и определения исходной концентрации сахара в крови). Кроликам одной группы вводят подкожно 0,5 ЕД стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам другой группы-такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т). Через 1,5 и 2,5 часа после введения инсулина у животных снова определяют концентрацию инсулина в крови.
Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара (х) в крови в процентах по формуле:
где а – исходная концентрация сахара в крови в мг/%;
в – средняя концентрация сахара в крови в мг/%.
Из двух определений проведенных через 1,5 и 2,5 часа после введения инсулина через 3-5 суток, на этих же кроликах проводят повторные испытания. Животным из группы получавший стандартный объем инсулина (S) вводят испытуемый раствор инсулина, а животным группы получавший (Т), вводят (S).
Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в крови на стандартный образец (% S) и на испытуемый препарат (%Т) по данным всего опыта. Относительная активность (R) испытуемого препарата выражают как отношение % Т к % S.
Для выражения активности испытуемого препарата инсулина (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А) умножают на относительную активность (R).
Т = R× A
Содержание сахара (глюкозы) в крови при определении биологической активности инсулина проводят феррицианидным или глюкозооксидным методом.
Феррицианидный метод:
К 5 мл 0,45% раствора цинка сульфата прибавляют 1 мл раствора натра едкого (0,1 моль/л) и 0,1 мл крови. Прививку помещают на кипящую водяную баню, после смесь фильтруют. К фильтрату прибавляют 2 мл раствора калия феррицианида, смесь помещают в кипящую водяную баню на 20 минут, затем охлаждают. К смеси прибавляют 3 мл 3% раствора уксусной кислоты и 2 капли 1% раствора крахмала. Освободившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата. Параллельно титруют контрольную пробу. Количество натрия тиосульфата зависит (пошедшего на титрование) от концентрации сахара в крови.
Эту концентрацию расщитывают с помощью специальной таблицы (ГФ XI изд. ст. 179). Окончательная величина содержания сахара в крови кролика равна разнице между концентрацией в опытной пробе и контрольной пробе.
Глюкозооксидазный метод заключается в определении оптической плотности глюкозы стандартного и испытуемого образца. Кровь 1 мл смешивают с 0,11 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Прибавляют 0,4 мл 5% раствора цинка сульфата и 0,4 мл раствора едкого натра, перемешивают и через несколько минут центрифугируют в течение 10 минут. К 1 мл над осадочной жидкости прибавляют 3 мл энзимо-хромогенного реактива, перемешивают и через 20 минут измеряют оптическую плотность раствора. Параллельно проводят определение оптической плотности раствора стандартного образца глюкозы с концентрацией 100 мг%.
Содержание глюкозы в пробе (ГФ ХI) рассчитывают по формуле:
х=
где Дх – оптическая плотность испытуемой пробы;
Дст – оптическая плотность раствора стандартного образца глюкозы;
С - концентрация глюкозы в растворе стандартного образца.
Для подтверждения диагноза сахарного диабета используют тесты толерантности к углеводам:
а). Тесты толерантности к глюкозе (ТТГ) (определение содержания глюкозы в крови). Через 2 часа после приема обследуемым пищи (эквивалентно 75г глюкозы). Уровень глюкозы в крови устанавливают ферментативным методом. Кровь для исследования берут из пальца до приема пищи, а также через 1 час и 2 часа после приема глюкозы.
б). Проба с двойной нагрузкой
Принцип исследования состоит в том, что если практически здоровому человеку в период снижения уровня глюкозы в крови, повторно ввести такое же как и употребленное накануне, количество глюкозы, то новое повышение ее концентрации в крови окажется значительно меньше первого подъема или его не будет вообще.
Отсутствие повышения содержания глюкозы в крови отражает большую интенсивность продукции инсулина поджелудочной железой. У больных инсулинзависимых сахарным диабетом, у которых понижена выработка инсулина, после второго введения глюкозы наблюдается столь же выраженное возрастание его концентрации в крови, как и после первой нагрузки.
Клиническое значение тестов толерантности к глюкозе с применением данных нагрузочных проб заключается в возможности обнаружения скрытых форм сахарного диабета.
К билету № 32.
В условиях биотехнологического производства:
1. Представьте каким образом и в какой последовательности при производстве ампициллина можно сочетать биосинтез, оргсинтез и биотрансформацию.
Производство ампициллина осуществляется в следующей последовательности: биотрансформация, биосинтез (получение 6-АПК), оргсинтез (6-АПК подвергают химическому ацелированию).
Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них. Высокая специфичность процессов биотрансформации и эффективность иммобилизованных ферментов нашли широкое применение для крупномаштабного производства антибиотиков и др. важных продуктов. По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты. К вторичным метаболитам относятся антибиотики-низкомолекулярные соединение, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.
|
| |||
Время, мин 1. Биомасса 2. Продукт
Ампициллин является полусинтетическим антибиотиком. Кислотоустойчивый и широкоспектровый препарат. Биосинтез полусинтетических пенициллинов.
Получение новых аналогов пенициллина основано на изменении природы его ацильной группировки при сокращении в неизмененном виде ядра пенициллина – 6 аминопенициллиновой кислоты. Кислоту получают в результате биосинтеза. В промышленности 6-АПК получают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента пенициллиназы, образующейся с высоким выходом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Ацилазы различают по их субстратной специфичности. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратное – процесс ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифицированного пенициллина – получено более 40000 полусинтетических пенициллинов. При превращении бензилпенициллина в ампициллин – 6 АПК не выделен из культурной жидкости.
Бензилпенициллин гидролизуют ацилазой мутанта ? citnophila при 7,8-8,0 и температуре 40-500 С. Затем в ферментатор вносят мутант Pseudonis melanogenum и фенициллин. Условия ферментации изменяют (pH 5,0 – 5,5), чтобы ацилаза второго мутантного организма осуществляла синтез ампициллина.
В ходе этого двухстадийного процесса разрушается только ампициллин [Д-) – а –аминобензолпенициллин).
К билету №33
В условиях биотехнологического производства:
1. Приведите основные виды микроорганизмов для создания препаратов пробиотиков.
2. Приведите основные требования к штаммам.
3. Укажите предпочтительную фазу роста микроорганизмов для получения препаратов пробиотиков.
Ответ: Наиболее часто для изготовления пробиотиков на основе живых микроорганизмов используют следующие виды микроорганизмов Bacillus subtilis, Bifidobacterium addescentis, B. Lonqum, Enterococeus Faecalis, E. Faecium, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, L. cassi, L. delbruecku subsp. bulgaricus, L. helveticus, fermentum, L. lactis, L. rhamnosus, L. salivarius, plantarum, Lackococcus, Leuconoskoc, Pediococcus, Propionibacterium acnes. Saccharomyces baclardii, Streptococcus cremoris. S. lactis, S. salivarius subsp thermophilum butiricum.
Требования к микроорганизмам, используемым в качестве основы пробиотиков.
- Они должны быть изолированы из организма тех видов животных и человека, для которых они и будут предназначены;
- Они должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями;
- При длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты;
- Они должны обладать колонизационным потенциалом, то есть сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия (быть устойчивыми к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, продуцируемым инди-генной микрофлорой; хорошо адгезироваться к эпителию соответствующих слизистых оболочек);
- Они должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане;
- Они должны обладать высокой скоростью роста и размножения и условиями, близкими таковым в кишечном тракте, при их культивировании in vitro для накопления биомассы следует создавать условия, максимально приближающие таковым микроокружения просвета кишечника;
- При введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью к транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду микроорганизма.
- Они должны иметь четкую физиолого-биохимическую и генетическую маркировку, как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации.
Технология продуктов функционального питания с использованием бифидобактерии и других микроорганизмов отличаются друг от друга, но в них схематично можно выделить несколько принципиально общих этапов.
1 этап – приготовление заквасочных культур
2 этап – подготовка сырья и материалов
3 этап – заквашивание питательной основы путем внесения в асептические ферментаторы производственной закваски и необходимом объеме и контроль за процессом по регламентированным параметрам (количество жизнеспособных клеток, рН, температура, содержание кислорода, время ферментации и т.д.). Наиболее часто бифидосодержащие закваски вносят в молоко, охлажденное до 40-42°С.
Так как у микроорганизмов различают несколько фаз роста то, предпочтительной стадией роста является III фаза – фаза логарифмического роста (I фаза – фаза приспособления; II – фаза ускорения роста или переходная; III фаза – фаза активного роста; IV – фаза уменьшения скорости роста, V фаза – стационарная; VI – фаза отмирания).
Введение в состав заквасок помимо производственных штаммов бифидобактерий, лактобацилл или молочнокислых стрептококков позволяет получать готовый молочнокислый продукт через 6-7 часов инкубации при 38°С, при этом количество бифидобактерий в готовом продукте достигает сотен миллионов живых клеток в 1 г. Обычно ферментацию ведут до достижения рН 4,8+0,4, после чего его без резкого перемешивания во избежание разрушения сгустка охлаждают до 20-25°С и расфасовывают. Именно при этой температуре готовый бифидосодержащий продукт, как и другие кисломолочные продукты, имеют наилучшую вязкость и стойкость сгустка. Процесс упаковки при указанной температуре не рекомендуется затягивать больше 2-х часов.
4 этап – асептический розлив
5 этап – контроль готовой продукции по органолептическим, микробиологическим и другим показателям.
К билету № 34
В условиях биотехнологического производства лекарственных средств:
1. Привести примеры антибиотиков-полиенов и списать механизм действия этих антибиотиков.
2. Объяснить причину появления термина в их отношении как «Золотой стандарт противогрибковых антибиотиков».
1. Антибиотики полиена-продуктами антибиотиков полиенов являются стрептомицеты и некоторые мицелиальные грибы, образующие структуры с четырьмя - семью сопряженными двойными связями (тетре-, пепта-, гекса- и гентаена).
Из группы полиеновых антибиотиков в медицинской практике известны нистатин, фумигиллин (тетреены), амфотерицин В (гентаен), и полусинтетический амфоглюкамин. Обладающие противогрибковым действием, преимущественно – в отношении патогенных дрожжевых организмов и некоторых других диморфных грибов).
Фумагиллин ингибирует стафиллококки, дизентерийную амебу, бактериофаги (нистатин) продуцент Streptomyces noursei – аналог амфотерицина В, но в его цепочке (позиции 20-27) содержится 4 конъюгированных двойных связей.
Полиены – группа макролизных антибиотиков, изменяющих проницаемость мембран чувствительных клеток. Полиены можно избирательно рассматривать отдельно от других препаратов на организмы, содержащие в своих мембранах стеролы. Так полиены активны в отношении дрожей, различных грибов и других дукариот, но не действуют на бактерии (за исключением микоплазм, выращиваемых в присутствии стеролов) и не сине-зеленые водоросли.
Все противогрибковые полиены имеют крупное лактонное колько, которое содержит гидроксилированный участок и систему незамещенных конъюгированных двойных связей, имеющих исключительно трансконфигурацию. Некоторые антибиотики могут содержать аминосахар, карбоксильную, или ароматическую боковые группы.
Лампен предложил следующую схему действия полиенов на мембраны.
Полиен + клетка Комплекс мембран-полиен
Понижение рН Измененная проницаемость
внутриклеточной среды мембраны
рН 5,5
-К+ Н+ Освобождение К+ и сахаров
Нарушение контрационных
механизмов
Концентрация Освобождение NH, Ф , фосфор-
полиенов ных эфиров, органических
к-т, нуклеотидов, нарушение
целостности клеток.
Освобождение белка
Чувствительные клетки дрожжей связывают нистатин при 30, но не при 0°С. В то время как протопласты связывают антибиотики как при 0°С так и при 30°С. Фрагменты мембраны протопластов быстро поглощают полиен при связывании с интантными клетками вероятно включает энергозависимую стадию, которая может быть необходима для обеспечения доступа антибиотика к участкам связывания на мембране. Пока не известно претерпевают ли полиены какую-либо модификацию при связывании и является ли этот процесс необратимым.
Полиены не связываются с клетками прокариот и не подавляют их роста.