Технология продуктов функционального питания

При использовании бифидобактерий и других микроорганизмов отличаются друг от друга, но в них схематично можно выделить несколько принципиально общих этапов.

1 этап – приготовление заквасочных культур. Для этого используют производственные штаммы микроорганизмов, которые предварительно прошли тщательную проверку на безопасность и имеют типически доказанный позитив или эффект на организм человека. Для изготовления каждой серии пробиотика или продукта функционального питания следует использовать новую ампулу лиофильно высушенных или хранящихся в условиях низких температур (40⁰ или в жидком азоте) бактерий. Это предотвращает возможность гибели культур, желательно, чтобы производственные культуры обладали способностью в течение 16-18 часов наращивать биомассу в таком количестве, чтобы к завершению процесса содержание микроорганизмов было не менее 10⁷ коэ/г готового продукта.

II этап – подготовка сырья и материалов. Используемые сырье и материалы также должны проходить тщательную проверку в соответствии с регламентируемыми Госсанэпиднадзором России требованиями к сырью и материалам, используемым для приготовления детских и лечебных продуктов питания. С микробиологической точки зрения наиболее целесообразно использовать в технологическом процессе стерильное сырье материала, что достигается применением специальных установок, позволяющих обеспечить высокотемпературную стерилизацию (110⁰С в течение нескольких секунд) или стерилизацию автоклавированием.

Отечественные производственные штаммы бифидобактрий, отобранные для изготовления кисломолочных продуктов, активно развиваются в цельном, обезжиренном и сгущенном молоке (при содержании в них сухих веществ не менее 18-24%). При этом содержание белка в молоке желательно иметь в пределах 3,7-4,0%, что достигается добавлением к исходному молоку 4% и более сухого обезжиренного молока. Для предотвращения в последующем готовом продукте синерезиса в процессе перемешивания, встряхивания, рекомендуется добавлять соединения, влияющие на вязкость и структуру кисломолочного бифидобактерина (камеди, пектины, агары, крахмал и другие в отдельности, так и в комбинации. Важным моментом при использовании стабилизаторов является гомогенизация и медленное нагревание молока с добавками до 50-70⁰ в течение 1,5-2 часов, позволяющие полноту их растворения, а формирование небольших казеиновых глобул, покрытых жиром. Последующее кратковременное выдерживание при высокой температуре (95-105⁰С в течение 5-10 мин или 110⁰ С в течение нескольких секунд) способствует окончательной элиминации микрофлоры из молока, освобождению его от остатков растворенного кислорода и возникновению в гнем специфических микроорганизмов

Ш этап - заквашивание питательной основы путем внесения в асептические ферментаторы производственной закваски в необходимом объеме и контроль за процессом по регламентированным параметрам (количество жизнеспособных клеток, рН, температура, содержание кислорода, время ферментации и т.д.). Наиболее часто бифидосодержащие закваски вносят в молоко, охлажденные до 40-42⁰С.

Введение в состав заквасок помимо производственных штаммов бифидобактерий лактобацилл или молочнокислых стрептококков, позволяет получить готовый молочно-кислый продукт через 6-7 ч инкубации при 38⁰С, при этом содержании бифидобактерий в готовом продукте достигает сотен миллионов живых клеток в 1 г. Обычно ферментацию ведут до достижения рН 1,8 ± 0,4, после чего его без резкого перемешивания во избежание разрушения сгустка охлаждают в 20-25⁰С и расфасовывают. Именно при этой температуре готовый бифидосодержащий продукт и другие кисломолочные продукты, имеют наилучшую вязкость. Процесс упаковки при указанной температуре не рекомендуется затягивать больше 2-х часов.

IV этап - асептический розлив

Асептически расфасованный продукт следует охладить с температуры 20-25⁰С до 6⁰С в течение 8-10 часов, поскольку ускоренное охлаждение может вызвать нарушение структуры кисломолочного продукта.

V этап – контроль готовой продукции по органолептическим, микробиологическим и другим показателям.

К билету № 23

В условиях биотехнологического производства аскорбиновой кислоты:

1. Укажите особенности технологии водорастворимых витаминов.

Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофы, в частности растения. Многие микроорганизмы также образуют целый ряд витаминов, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основной для разработки технологий промышленного производства их биологически активных соединений.

К водорастворимым витаминам относятся витамины группы В (В₁,В₂,В₆,В₁₂), РР, С.

Благодаря изучению физиологии и гинетики микроорганизмов – продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза из них, создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В₂ и В₁₂. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либор синтезируют химическим путем. Например, в ткачестве продуцентов витамин В₁₂ могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы.

Методами генной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образующий около 6 г рибофлавина (вид В₂) в 1 л среды.

Единственный способ получения витамина В₁₂ в настоящее время-микробиологический сиснтез.

Продуцентами витамин В₁₂ при его промышленном получении служат актиномицеты, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. В последние годы исследуется возможность получения витамина с использованием иммобилизованных клеток пропионовокислых бактерий.

Аскорбиновая кислота, или витамин С – это противоцингойный витамин, имеющийся у всех высших растений и животных; только человек и микробы не синтезируют ее. Однако определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу полупродукта этой кислоты – L –сорбазы. Весь процесс получения аскорбиновой кислоты является смешанным, есть химикоферментативным.

2.Приведите стадию использования биотрансформации в производстве аскорбиновой кислоты.

CH₂OH

гидрирование

HOH₂C (CHOH)₄ CH₂OH

Д – глюкоза Д – сорбит

Gluconobaсter oxydans HOH₂CCO(CHOH)₃ CH₂O

Биологическое окисление L – сорбоза

рН= 5,0

химический процесс О

(трансформация) H

CO – C = C – C – C – CH₂OH

OH OH H OH

L – аскорбиновая кислота

Биологическая стадия процесса

Катализируется мембраносвязанной полиолдегидрогенозой, образуется полупродукт.

Химическая стадия процесса включает последовательно следующие этапы: конденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон – L – сорбозы, окисление диацетон – L – сорбозы до диацетон – кето – L – гулоновой кислоты, подвергают затем гидролизу с получением 2-кето-L-гулоновой кислоты, последнюю подвергают это энолизации с последующей трансформацией в L – аскорбиновую кислоту.

К билету 24

Биотехнология – это направление научно-технического прогресса, использующее биологические процессы и агенты для целенаправленного воз­действия на природу, а также в интересах промышленною получения по­лезных для человека продуктов, в частности, лекарственных средств

Уже в самом определении предмета отражены его местоположение как пограничного, благодаря чему результаты фундаментальных исследовании в области биологических, химических и технических дисциплин приобретают выражение прикладное значение.

Возникновение, становление и развитие биотехнологии условно можно подразделить на четыре периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический.

К тому же эмпирическому периоду относятся получение кисло­молочных продуктов, квашенной капусты, меновых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.

Второй, этиологический период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть XX в. (1856 - 1933 г.г.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 - 1895 г.г.) - основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин.

Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах использован в целях «воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.). В этот период было начато изготовление пищевых прессованных дрожжей, а также некоторых продуктов обмена (метаболизма) ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот. Во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод

Третий период развития биотехнологии - биотехнический, начался в 1933 году, когда была опубликована работа А. Клюйвера и Л.Х.Ц. Перкина "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложены основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. После этого началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечивающего проведение процессов в стерильных условиях.

Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (1939 – 1945). Работами многих ученых были показана возможность механизации процессов брожения, культивирования различных клеток и различных клеточных продуктов для нужд человека и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: антибиотики (пенициллин, стрептомицин, тетрациклин), декстран, ряд аминокислот и другие.

К медицинской биотехнологии относятся производственные процессы, которые завершаются созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицинского назначения (диагностического, профилактического и лечебного действия). Это антибиотики, некоторые витамины, коферменты и ферменты, отдельные микробные полисахариды, которые могут применяться как самостоятельные средства или вспомогательные вещества при создании различных лекарственных форм, аминокислоты, нуклеозиды и др.

Иммунобиотехнология объединяет производство вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, моноклональных антител и др. Можно заметить, что на основе иммунобиотехнологических процессов создаются также профилактические лечебные средства. Вместе с тем, иммунобиотехнологические процессы по целевым продуктам вышли за пределы медицинского назначения. Например, большинство ферментов, аминокислот и др. производятся не для целей здравоохранения.

Достижения приведенных выше направлений биотехнологии, медицинской биотехнологии и иммунобиотехнологии позволяют говорить в настоящее время о биотехнологии лекарственных средств.

Обычно биотехнологическая стадия начинает технологический процесс (получение необходимой биомассы путем культивирования клеток меристемы лекарственных растений) как это имеет место при производстве диосгенина, дигоксина, аймалина и др. Известны такие производства, в которых биотехнологический этап выступает в качестве промежуточного (перевод сорбита в сорбозу при получении витамина С в среде культивирования уксуснокислых бактерий). При использовании биотехнологий в фармации их реализуют выращиванием культур тканей высших растении в виде каллуса, суспензионным культивированием клеток животных и растений, культивированием химерных клеток, в геном которых встроены опероны, ответственные за биосинтез лекарственной субстанции. Кроме того, биотехнологии могут успешно конкурировать с тонкими химическими технологиями на отдельных этапах изготовления лекарственного средства, а в ряде случаев (например, синтез витамина B₁₂) в состоянии обеспечить всю последовательность сложных химических реакций, необходимых для превращения исходного предшественника в конечный продукт.

Инженерная энзимологии - это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или составе живых клеток для получения соответствующих целевых продуктов. Биообъект здесь - фермент (или комплекс ферментов). На практике обычно используется иммобили­зованные ферменты (реже - иммобилизованные клетки), благодаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная активность.

Задачи, стоящие перед биотехнологией.

1. Поддержание и активизация путей обмена клеток, ведущих к накоплению целевых продуктов при заметном подавлении других реакции обмена у культивируемого организма.

2. Получение клеток или их составных частей (преимущественно ферментов) для направленного изменения сложных молекул.

3. Углубление и совершенствование генетической инженерии, включающей р ДНК-биотехнологию и клеточную инженерию, с целью получения особо ценных результатов в фундаментальных и прикладных разработках .

4. Создание безотходных и экологически безопасных биотехнологических процессов.

5. Совершенствование и оптимизация аппаратурного оснащения биотехнологических процессов с целью достижения максимальных выходов конечных продуктов при культивировании лекарственных видов с измененной наследственностью методами клеточной и генной инженерии.

6. Повышение технико-экономических показателей биотехнологических процессов по сравнению с существующими.

К билету № 25.

В условиях биотехнологического современного производства лекарственных средств:

1. Определите понятие и значение клеточной инженерии.

2. Укажите цели, достигаемые с помощью клеточной инженерии.

Приведите примеры.

Клеточная инженерия – это метод конструирования эукариотических клеток с новой генетической программой. С помощью клеточной инженерии можно получать гибриды соматических клеток бактерий, растений, животных Клеточная инженерия объединяет ряд методов манипуляций с клетками растений и животных – соматическая гибридация, манипуляция с эмбрионами и т.д.

Значение клеточной инженерии состоит в том, что с помощью ее достижений можно:

- проводить диагностику наследственных болезней человека на раннем этапе;

- лечить ранее неизлечимые болезни, так как рак;

- получать гибриды не родственных видов растений, повышая тем самым их продуктивность (решается продовольственная проблема);

- получать клоны высокопродуктивных животных (решается продовольственная проблема).

Клеточная инженерия позволяет:

- преодолеть физиологическую несовместимость и скрещивать неродственные виды растений (с помощью соматической гибридизации – слияние (фузия) лишенных оболочки соматических клеток или их частей– получены гибрид помидора с картофелем, гибрид помидора с картофелем, гибрид дикого и –культурного картофеля, устойчивого к вирусам).

- создать гибридомы (клетки, полученные путем слияния (фузии) соматических клеток животных (или человека) и клеток опухоли – миеломы). С помощью гибридов получают моноклональные антитела для лечения и диагностики различных заболеваний человека. Моноклональные антитела используют для диагностики беременности, инфекционных заболеваний, различных форм рака, ряда наследственных заболеваний; выявление предрасположенности к диабету, ревматоидному артриту. Моноклональные антитела используют также и в качестве лекарств. Используется их возможность подавлять иммунный ответ организма при пересадке органов. Моноклональные антитела соединенные с токсинами используют для лечения рака и др.

- проводить пересадку соматических ядер в зрелые яйцеклетки с целью клонирования (получение идентичных копий) взрослых животных. В феврале 1997г. осуществлено клонирование взрослой овцы.

Для получения потомства авторы методики слили две клетки: ядро соматической клетки взрослой овцы, полученной из клеточной культуры в определенной стадии роста, переносилость в неоплодотворенную яйцеклетку с удаленнным ядром.

Полученная таким образом яйцеклетка иплантировалась овце, которая естественным образом выносила и родила ягненка. Главная цель, которую ставили перед собой авторы, - доказать, что в дифференцированных клетках различных органов взрослых млекопитающих не происходит необратимых изменений генетического материала, и они могут при соответствующих условиях дать жизнь новому организму. Авторы отличают возможность применения своего достижения в сельском хозяйстве для улучшения генетики популяции животных, так как можно получить точные копии самых удачных животных, в том числе трансгенных.

К билету № 26

В условиях биотехнологического производства лекарственных средств.

1. Определите, какая из стадий многостадийного процесса получения аскорбиновой кислоты осуществляется биотехнологическим путем и с помощью каких микроорганизмов.

Аскорбиновая кислота, или витамин С – это противоцинготный витамин, имеющийся у всех высших растений ее животных; только человек и микробы не сиснтезируют ее, но людям она неотложно необходима, а микробы не нуждаются в ней. И тем не менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосиснтезу полупродукта этой кислоты – L- сорбоза. Таким образом, весь процесс получения аскорбиновой кислоты является смешанным, то есть химико-ферментативным.

СН₂ОН

гидрирование Gluconobacter oxydans

НОН₂С(СНОН)₄ СН₂ОН биологическое

Д - сорбит окисление рН = 5,0 Д- глюкоза

химический процесс

НОН₂ССО(СНОН)₃ СН₂ОН

L - сорбоза (трасформация)

О

H

СО – С = С – С – С – СН₂ОН

ОН ОН Н ОН

L – аскорбиновая кислота

Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвязанной полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает последовательно следующие этапы: корденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон –L – сорбозы, окисление диацетон – L –сорбозы до диацетон – 2-кето- L-гулоновой кислоты, подвергаемой затем гидролизу с получением 2-кето – L- гулоновой кислоты, последнюю подвергают энолизации с последующей трансформацией в L – аскорбиновую кислоту.

Ферментацию G. охуdans проводят на средах, содержащих сорбит (20%), кукурузный или дрожжевой экстракт при интенсивной аэрации (8-10гO₂/л/г)

Выход L- сорбозы может достичь 98% за одни-двое суток. При достижении культурой вод-фазы можно дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию до 25%. Также установлено, что G. oxydans может окислять и более высокие концентрации полиспирта (30-50%), создаваемые на последних стадиях процесса. Это происходит благодаря полиолдегидрогеназы, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме. Принципиально доказана возможность получения L- сорбозы из сорбита с помощью иммобилизованных клеток в ПААГ.

К билету №27

В условиях биотехнологического производства лекарственных средств:

1. Определите значение генетической инженерии.

2. Перечислите видоспецифические белки человека, полученные методами генетической инженерии.

3. Укажите преимущества белковых препаратов полученных методом генетической инженерии.

Генетическая инженерия – ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности создания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных органов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отнести синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, витаминов и др.

Генетическая инженерия – методы генетической инженерии широко используются в биотехнологическом производстве лекарственных средств таких, как инсулин, соматотропин, интерфероны, вакцины против гепатита В, ферментов.

До появления технологии рекомбинантных ДНК, многие лекарственные препараты на основе белков человека удалось получить только в небольших количествах, достаточных для применения в клинике. В настоящее время клонированы более 400 генов (в основном в виде ДНК) различных белков человека, которые могут быть лекарственными препаратами. По подсчетам специалистов ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12-14% в год, а к 2000 году составил примерно 200 млрд. долларов.

Методами генетической инженерии в настоящее время получают некоторые видоспецифические белки человека – наиболее значимые в клинике человека:

- адренокортикотропный гормон;

- гемоглобин;

- гормон роста (соматотропин);

- инсулин;

- инсулиноподобный фактор роста;

- интерфероны a, b, γ;

- лимфотоксин;

- соматолиберин;

- сывороточный альбумин;

- тиреотропный гормон;

- урокиназа;

- хорионический гонадотропин и др.