Из чего делают растения

Клещенко Е.

(«ХиЖ», 2011, №8)

http://www.hij.ru/read/detail.php?ELEMENT_ID=537&sphrase_id=3838

Всё выполнимо на свете!

Словно молоденький ствол,
Раз под рукою поэта
Посох цветами зацвел...

Новелла Матвеева

Садовод покупает черенок яблони; любитель узамбарских фиалок бережно несет домой мохнатый листок, подаренный единомышленником; в метре от тополя с обломанной вершиной из земли лезет целая роща молодых побегов — всё это примеры вегетативного размножения у растений. А вегетативное размножение — это, согласно словарю, образование новой особи из многоклеточной части тела родительской особи. Многоклеточная часть может быть как специально предназначенной для размножения (клубень, луковица), так и неспециализированной (побег, почка, участок стебля или корня). Но в любом случае это будет бесполое размножение, при котором растение-потомок генетически идентично материнскому.

У многоклеточных животных вегетативное размножение — скорее редкость, а в царстве растений оно широко распространено. Широко, однако не повсеместно. Кто из нас не огорчался в детстве, когда узнавал, что сорванные полевые цветы не могут пустить корни и обязательно завянут! Некоторые растения ни в какую не желают размножаться вегетативно, другие «согласны» только на определенные способы (скажем, луковица, но не лист). Почему так и от чего это зависит — важный вопрос как для теоретической биологии, так и для практических нужд.

Зададим чисто теоретический вопрос: а каков минимальный размер этой самой многоклеточной части, способной дать жизнь новому растению? (Для практических целей, понятно — чем меньше, тем лучше бы.) Чисто теоретический ответ: в пределе должно хватить и одной клетки. В ней имеется вся необходимая генетическая информация, да и при половом размножении зародыш развивается из одной клетки, которая образована слиянием яйцеклетки и спермия, проникшего в завязь из пыльцевой трубки... На самом деле в так называемом двойном оплодотворении у цветковых растений участвуют минимум пять клеток (яйцеклетка плюс один спермий дают зародыш, две полярные материнских клетки плюс еще один спермий — эндосперм, источник питательных веществ для зародыша в семени, подробности смотри в школьном учебнике ботаники). Как мы увидим далее, это важно. Но в принципе всё верно: каждое живое существо, а значит, и каждое растение, от фиалки до секвойи, начиналось с единственной клетки. И даже десяток клеток с точки зрения быстрого и дешевого размножения выгоднее, чем целый клубень.

Лабораторные эксперименты подтвердили: целое растение можно вырастить из крохотного кусочка ткани in vitro — в пробирке, колбе или чашке Петри, в стерильных условиях. Эксплантом, то есть родоначальником культуры, может быть и почка, и побег, и фрагмент стебля или корня.

Идеи о возможности культивировать растительные клетки впервые возникли еще на рубеже XIX и XX веков, но, чтобы воплотить их в жизнь, потребовалось много экспериментов. Способность культур растительных тканей к неограниченному росту в 30-е годы показал французский исследователь Роже Готре и независимо от него — американец Филипп Уайт. (Пишут, что культура каллусной ткани моркови, полученная Готре, сохранила жизнеспособность до наших дней.) К перспективной теме обратилось множество ученых по всему миру, и в следующие два десятилетия были достигнуты значительные успехи. Американский ученый Фредерик Стюард, работая с тканью моркови, получил из нее в 1958 году целые растения. В монографии Готре «Культура растительных тканей», вышедшей годом позже, упоминаются уже 142 вида высших растений, выращиваемых in vitro (эта монография впервые была издана на русском языке в 1949 году). Сегодня, если вы наберете в окошке поисковика «тканевая культура», а лучше «tissue culture», то найдете подробные инструкции для учителей биологии, желающих повторить в классе опыты Готре и Стюарда, и сайты любителей редких растений, испытывающих на своих любимцах современные биотехнологии. Теперь это возможно, но тогда всё было впервые.

В нашей стране технологии культивирования клеток высших растений также появились в конце 50-х. Здесь в первую очередь следует упомянуть Раису Георгиевну Бутенко (1920–2004), члена-корреспондента АН СССР с 1974 года, в 1984-м получившую вместе с коллегами Государственную премию за «разработку фундаментальных основ клеточной (генетической) инженерии растений». В конце 50-х годов под ее руководством была создана лаборатория изолированных тканей и органов растений Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева. Сейчас это отдел биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН — именно там были выполнены многие из тех пионерских работ, о которых мы будем говорить дальше.

Идея культуры растительных клеток кажется простой: возьмите кусочек растительной ткани, по возможности свободной от посторонних микроорганизмов, и поместите эксплант на специальную среду. Наибольшее распространение получила среда Мурасиге — Скуга (она названа в честь Тосио Мурасиге и Фольке Скуга, работавших в Висконсинском университете в Мэдисоне) и ее модификации. Среда содержит агар-агар (по консистенции она похожа на твердый холодец), сахарозу и минеральные вещества. В нее также добавляют антибиотики, чтобы подавить размножение бактерий, и, главное, растительные гормоны, или фитогормоны, — вещества, регулирующие рост и направление развития клеток.

Первое, что происходит с клетками в культуре, — дедифференциация. Они утрачивают характерные признаки клеток листа или корня и становятся «просто клетками», способными дать начало каждой из тканей растения. Фактически этому способствует само отделение кусочка ткани, освобождающее клетки от диктата организма. Известно, что судьбу клетки в значительной мере определяют ее окружение, характер контактов с другими клетками, хотя механизм этого влияния изучен не до конца.

Многие растительные гормоны хорошо знакомы современным цветоводам и огородникам, и для них не будет неожиданностью, что клетки в культуре заставляет делиться определенная комбинация ауксинов и цитокининов. Сравнительно высокие концентрации ауксинов стимулируют рост, причем особенно активно влияют на корнеобразование. Гиббереллины также стимулируют рост, ускоряют развитие листвы, созревание семян. Абсцизовая кислота, напротив, — гормон покоя: она останавливает созревание плодов, тормозит прорастание, уменьшает испарение влаги листьями, замедляет синтез ферментов, участвующих в фотосинтезе, а название ее происходит от abscission — «опадение листьев». Созреванием плодов и листопадом управляет также этилен. На самом деле об эффектах растительных гормонов, об их взаимодействиях между собой можно сказать еще многое, но главное понятно: это инструменты, с помощью которых биотехнолог может работать с культурой клеток, как скульптор с глиной и металлом. То есть получать всё, что ему угодно, в пределах возможностей материала.

Из делящихся клеток в культуре образуется каллусная ткань (до эры клеточных биотехнологий каллусом называли аморфные шрамы и наплывы, закрывающие раны растений). Через определенный срок часть каллуса пересаживают на новую среду. Иногда бывает удобно вместо твердой среды использовать жидкую и растить культуру в колбе на качалке — тогда клетки и их небольшие скопления образуют в растворе суспензию. В некоторых случаях клетки обрабатывают специальными ферментами, разрушающими твердую клеточную стенку, — такие «голые» клетки называют протопластами (для чего это бывает нужно, расскажем позже).

Интересно, что не все клетки в культуре одинаковы, несмотря на генетическую идентичность исходного материала и, казалось бы, идентичные для всех условия. В культуре действуют свои факторы отбора. Вот лишь один пример, который приводит в популярной статье заведующий отделом биологии клетки и биотехнологии ИФР доктор биологических наук, профессор А. М. Носов: «Культура клеток может существовать только в цепи последовательных пересадок. В подобных условиях вероятность «попадания» в следующий цикл роста выше у потомства интенсивно делящихся клеток. Другими словами, в условиях пересадочной культуры изолированных клеток происходит их отбор по признаку интенсивной пролиферации, то есть деления. Достаточно большое число пересевов приведет к тому, что в культуре будут преобладать клетки, темп деления которых будет повышен по сравнению с исходным» («Биология в школе» 2004, № 5).

Клетки в пересеваемой культуре различаются по множеству признаков: форме и размеру клетки, способности к синтезу и накоплению различных веществ и даже генетически — например, по числу наборов хромосом. (Это установили Р. Г. Бутенко и З. Б. Шамина в Институте физиологии растений.) С одной стороны, это замечательно: есть гетерогенность — значит, есть рычаги воздействий на клетки и материал для отбора. С другой стороны, необходимо иметь в виду, что растение, выращенное из культуры, может и не быть в точности таким же, как исходное.

Выращивать новые растения из культуры клеток (такие растения называют регенерантами) можно различными способами. Если из каллуса развиваются органы растения — корни или побеги, а из побега, в свою очередь, вырастает целостное растение, то говорят об органогенезе. Одна из возможных схем — микропобеги укореняют в растворе или среде с ауксином, а когда корневая система становится достаточно развитой, маленькое растение извлекают пинцетом или специальным крючком и высаживают в простерилизованный грунт. Этот сценарий напоминает вегетативное размножение в природе. Но есть и другой путь: соматический эмбриогенез. При этом из клеток культуры в определенных условиях формируются зародыши растений — эмбриоиды, почти такие же, как в семенах, и уже из них получают растения-регенеранты.

А теперь от теоретических вопросов перейдем к практике. Для чего нужны методы клеточной инженерии, позволяющие выращивать и размножать растения «в пробирке»?