Andio R., D. Silvera, S. D. Suggett, P. L. Achacoso, 4 страница
Hahn S. K., Υ. Κ. Chang,S. Y. Lee.1995. Recovery and characterization of poly(3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligenes eutropfius and recombinant Escherichia coli. Appl, Environ. MicrobioL 61:34-39.
Нillemann D., A. Puhler, W. Wollenen. 1УУ1. Gene disruption and gene replacement in Streptomyces via single stranded DNA transformation of integration vectors. Nucleic Acids Res. 19:727-731.
Hopwood D. A., M. J. Bibb, C. J.Bruton, K. F. Chater, J. S. Fcitelson, J.A. Gil.1983. Cloning Streptomyces genes for antibiotic production. Trends Biotechnol. 1:42-48.
Hopwood D.A., F.Malpartida, H. M. Kicser, H. Ikeda, J.Duncan, I. Fujii, B. A. M. Rudd, H. G. Floss, S. Omura.1985. Production ofhybrid antibiotics by genetic engineering. Nature 314: 642-644.
Howard K. A., C. Card, J. S. Benner, H. L. Callahan, R. Maunus, K. Silber, G. Wilson, J. E. Brooks.1986. Cloning the Dde\ restriction-
Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 273
modification system using a two-step method. Nucleic Adds Res. 14: 7939-7951.
Hutchirtson С R., H. Decker, K.Madduri, S. L. Otten, L. Tang.1993. Genetic control of polyketide biosynthesis in the genus Streptomyces. Anîonie Leeuwcnhfjt'kM: 165—176.
Hutchinson С. R.1994. Drug synthesis by genetically engineering microorganisms. Bio/Technology 12: 375-380.
Hutchinson C. R-, I. FujiL1995. Polyketide synthase gene manipulation: a structure-function approach in engineering novel antibiotics. Anna. Rev. Microbiol. 49: 201-238.
Iked M., K.Nakanishi, K. Kino, R. Katsumata.1994. Fermentative production of tryptophan by a stable recombinant strain of Cotynebacterium glutatnicum with a modified serine-biosynthetic pathway. B'ioscL B'toîechnol. Biochem. 58: 674-678.
Ischida M., K. Miwa, S. Nakamori, K. Sano.December 1989. Process for producing L-trypto-phan. U.S. patent 4, 885, 245.
Isogai T., M. Fukagawa, I. Aramori, M. Iwami, H. Kojo, T. Ono, Y. Ueda, M. Kohsaka, H.Imanaka. 1991. Construction of a 7-aminocephalosporanic acid (7ACA) biosynthetic operon and direct production of 7ACA in Acremonium chtysogenum. Bio/Technology 9: 188-191.
Katz L., S. Donadio.1993. Polyketide synthesis: prospects for hybrid antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 47:875-912.
Kleinkauf H., H. von Dohren.1990. Antibiotics—cloning of biosynthetic pathways. FEBS Lett. 268:405-407.
Krämer R.1996. Genetic and physiological approaches for the production of amino acids. J. Biotechnol. 45: I-2 L
Lazarus R. A., M. Hurle,S. Anderson, D. B. Powers.December 1994. Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid. U.S. patent 5. 376, 544.
Lee S. Y., H. N. Chang, Y. K. Chang.1994. Production of poly(ß-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia со//. Ann. N.Y. Acad. Sei. 721: 43-53.
Lee S. Y., K. S, Yim, H. N. Chang, Y. K. Chang.1994. Construction of plasmids, estimation of plasm id stability, and use of stable plasmids for the production of poly{ß-hydroxybutyric acid)
by recombinant Escherichia со//. J. Biotechnol. 32:203-211.
Lee S. Y., H. N. Chang.1995. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coti strains: genetic and fermentation studies. Can. J. Microbiol. 41: 207-219.
Magneto S. K., D. L. Lecnutaphong, J. A. DcModcna, J. E.Curtis, J. E. BailOey, J. 1., Galazzo, D. E. Hughes.1991. Actinorhodin production by Streptomyces coelicolor and growth of Streptomyces lividans are improved by the expression of a bacterial hemoglobin. Bio/Technology 9:473-476.
Martin J. F.1987. Cloning of genes involved in penicillin and cephalosporin biosynthesis. Trends Biotechnol. 5: 306-308.
Mi-Daniel R., S. Ebert-Khosla, D. A. Hopwood, C. Khosla.1995. Rational design of aromatic polyketide natural products by recombinant assembly of enzymatic subunits. Nature 375: 549-554.
Mcrmod N., S. Harayama, K. N. Timmis.1986. New route to bacterial production of indigo. Bio/Technology 4: 321-324.
Ozaki A., R. Katsumata, T. Oka.October 1989. Process for producing tryptophan. U.S. patent 4, 874, 698.
Piekaruwicz A., R. Yuan, D. C. Stein.1991. A new method for the rapid identification of genes encoding restriction and modification enzymes. Nucleic Acids Res. 19: 1831-1835.
Rhic H. G., D. Dennis.1995. Role of fadR and otoC(Con) mutations in poly{3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) synthesis in recombinant pha + Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 61:2487-2492.
Salerno A. J., I. Goldberg. 1993. Cloning, expression, and characterization of a synthetic analog to the bioadhe-sive precursor protein of the sea mussel Mytilus edulis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:221-226.
Schwarzer Α., A. Puhler.1991. Manipulation of Corynebacteriwn glutamicum by gene disruption and replacement. Bio/Technology 9: 84—87.
Sikora L, A.January 1991. DNA fragment encoding a rubber polymerase and its use, U.S. patent 4. 983, 729.
Stachelhaus T., A. Schneider, M. A. Marahiel.1995. Rational design of peptide antibiotics by targeted replacement of bacterial and fungal domains, Science 269:69-72.
274 ГЛАВА 12
Strausberg R. L., R. P. Link.1990. Protein-based
medical adhesives. Trends ftiotecfinol. 8: 53—57.
Terasawa M., M. Fukushima, Y. Kurusu, H. Yukawa.1990. L-Tryptophan production by the application of highexpressed tryptophanase in Escherichia coli. Process Biochem. In}. 25:172-175.
Walder R. Y., J. L. Hartley, J. E. Dondson, J. A. Wälder.1981. Cloning and expression of the Pstl restriction-modification system in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1503-1507.
Weber J. M., J. O. Leung,S. .1.Swanson, К. B. Idler, J. B. McAlfHne. 1991.An erythromycin derivative produced by targeted gene disruption inSaccharopolyspora crythracea. Science252: 114-117.
Yim K. S., S. Y. Lee, H. N. Chang. 1996.Synthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvaler-ate) by recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 49:495-503.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Опишите стратегию выделения гена эндонуклеазы рестрикции EcoRI.
2. Опишите стратегию клонирования гена 2,5-DKG-редуктазы Corynebacterium в Erwinia. Почему это представляет интерес?
3. Предложите стратегию повышения коммерческой ценности клонированного гена 2,5-DKG-редуктазы.
4. Как синтезировать индиго в E. coli?
5. Как повысить количество триптофана, синтезируемого Corynebacterium glutamicum?
6. Предложите стратегию выделения генов, участвующих в биосинтезе антибиотика ундецилпродигиозина, который обычно синтезируется в Streptomyces coelicolor.
7. В чем состоит трудность трансформации различных разновидностей Streptomyces? Как ее преодолеть?
8. Как с помощью генной инженерии увеличить продукцию антибиотика данным штаммом Streptomyces?
9. Опишите один из подходов к созданию модифицированных вариантов неароматических поликетидных антибиотиков типа эритромицина.
10. Как адгезивный белок, обычно синтезируемый мидией Mytitus edulis, можно синтезировать в E. coli?
11. Опишите схему синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) в E. coli.
12. Что такое сыворотка? Какие важные в промышленном отношении соединения можно из нее получить и каким образом?
ГЛАВА 13.
Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы
Еще относительно недавно ни у кого не возникало сомнения в том, что окружающая среда — воздух, земля и вода — всегда будут эффективно «перерабатывать» бытовые, промышленные и сельскохозяйственные отходы. Теперь мы знаем, что это не так. Человечество столкнулось с двумя фундаментальными проблемами: переработкой отходов, постоянно образующихся в огромном количестве, и разрушением токсичных соединений, десятилетиями накапливавшихся на свалках, в воде и почве. Правительства разных стран пытались решить эти проблемы законодательным путем, однако к успеху это не привело.
В настоящее время проходит проверку целый ряд технологических, в том числе и биотехнологических, подходов, с помощью которых, возможно, удастся перерабатывать большие количества отходов (например, лигноцеллюлозы) и токсичные вещества. Предпринимаются попытки поощрять те предприятия, которые перерабатывают отходы производства и повторно используют содержащиеся в них полезные вещества.
Употребляемый нами здесь термин «биодеградация» относится к процессу разрушения отходов, попавших в окружающую среду, с помощью живых микроорганизмов, а термин «биомасса» — ко всей совокупности веществ и материалов — побочных продуктов пищевой и перерабатывающей промышленности, — которые раньше считались отходами, а теперь могут служить сырьем для производства многих экономически важных продуктов.
Деградация ксенобиотиков с помощью микроорганизмов
Проблема утилизации токсичных отходов сейчас стоит очень остро. В 1985 г. мировое производство лишь одного из загрязняющих окружающую среду химических веществ, пентахлорфенола, составило более 50 000 т. Раньше токсичные вещества разрушали, сжигая их или обрабатывая другими химикатами, однако это тоже приводило к загрязнению окружающей среды, а кроме того, обходилось очень дорого. В середине 1960-х гг. были обнаружены почвенные микроорганизмы, способные к деградации ксенобиотиков (неприродных, синтетических химических веществ; от греч. xenos, чужой) — гербицидов, пестицидов, хладагентов, растворителей и т. д. Это открытие подтвердило правильность предположения о том, что микроорганизмы можно использовать для экономичного и эффективного разрушения токсичных химических отходов.
Основную группу почвенных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, составляют бактерии родя Pseudomonas. Биохимические исследования показали, что разные штаммы Pseudomonas способны расщеплять более 100 органических соединений. Нередко один штамм использует в качестве источника углерода несколько родственных соединений.
В биодеградации сложной органической молекулы обычно участвуют несколько разных ферментов. Кодирующие их гены могут иметь хромосомную локализацию, но чаще входят в состав крупных (50—200 т. п. н.) плазмид (табл. 13.1), а
276 ГЛАВА 13
иногда обнаруживаются как в хромосомной, так и в плазмидной ДНК.
Бактерии, разрушающие негалогенированные ароматические соединения, как правило, превращают их в катехол (рис. 13.1) или протокатехоат (рис, 13.2), а затем, в ходе нескольких реакций окислительного расщепления, — в ацетил-СоА и сукцинат (рис. 13.3) или пируват и ацетальдегид (рис. 13.4). Эти последние соединения метаболизируются практически всеми микроорганизмами, Галогенированные ароматические соединения, основные компоненты большинства пестицидов и гербицидов, с помощью тех же ферментов разрушаются до катехола, протокатехоата, гидрохинона или их галогенированных производных, причем скорость их деградации обратно пропорциональна числу атомов галогена в исходном соединении. Дегалогенирование (отщепление замещающего атома галогена от органической молекулы), необходимое для детоксикации соединения, часто осуществляется в ходе неспецифической диоксигеназной реакции, путем замещения галогена в бензольном кольце на гидроксильную группу. Эта реакция может происходить как в ходе биодеградации исходного галогенированного соединения, так и потом.
Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков, созданные методами генной инженерии
Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако следует иметь в виду, что: I ) ни один из них не может разрушать все органические соединения; 2) некоторые органические соединения в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов; 3) большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушать один или несколько ее компонентов, может инактивироваться другими компонентами; 4) многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными; 5) биодеградация органических соединений часто происходит довольно медленно. Часть этих проблем можно решить, осуществив конъюгационный перенос плазмид, которые кодируют ферменты разных катаболических путей, в один реципиентный штамм (рис. 13.5). Если две плазмиды содержат гомологичные участки, то между ними может произойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обладает свойствами исходных плазмид. Если же две плазмиды не содержат гомологичных участков и относятся к разным группам несовместимости, то они могут сосуществовать в одной бактерии.
Перенос плазмид
В 1970-х гг. Чакрабарти и его коллегами был создан первый бактериальный штамм, обладающий более широкими катаболическими возможностями. Он расщеплял большинство углеводородов нефти и был назван «супербациллой». Для его получения использовали плазмиды, каждая из которых кодировала фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов: плазмида САМ детерминировала деградацию камфары, ОСТ — октана, NAH — нафталина, XYL — ксилола (рис. 13.5). Сначала путем конъюгации пере-
| Таблица 13. 1. Плазмиды Pseudomonas, их размер и соединения, за разрушение которых ответственны кодируемые ими ферменты1) | |||
| Плазмида2) | Деградируемое соединение | Размер плазмиды, т. п. н. | |
| SAL | Салицилат | ||
| SAL | Салицилат | ||
| SAL | Салицилат | ||
| TOL | Ксилол и толуол | ||
| pJP1 | 2 ,4 - дихлорфеноксиуксусная | ||
| кислота | |||
| pJP2 | 2,4-дихлорфеноксиуксусная | ||
| кислота | |||
| pJP3 | 2 ,4- дихлорфеноксиуксусная кислота | ||
| CAM | Камфара | ||
| XYL | Ксилол | ||
| pAC31 | 3,5-дихлорбензоат | ||
| pAC25 | 3-хлорбензоат | ||
| pWWO | Ксилол и толуол | ||
| NAH | Нафталин | ||
| XYL-K | Ксилол и толуол | ||
| 1) Из работы Cork, Krueger, Adv. Appl. Microbiol. 36: 1-66, 1991, с изменениями. | |||
| 2) Плазмиды с одинаковым названием кодируют ферменты одного и того же катаболического пути, хотя могут быть получены в разных лабораториях и иметь разные размеры. |
Биодеградация и утилизация биомассы 277
 |
| Рис. 13.1. Пути ферментативного превращения ароматических соединений в катехол бактериями, разрушающими ксенобиотики. |
278ГЛАВА 13
 |
| Рис. 13.2. Пути ферментативного превращения ароматических соединений в протокатехоат бактериями, разрушающими ксенобиотики. |
Биодеградация и утилизация биомассы 279
| Рис. 13.3. Путь орто-расщепления при ферментативном превращении катехола и протокатехоата в ацетил-СоА и сукцинат. |  |
несли плазмилу САМ в штамм, несущий плазмиду ОСТ. Эти две плазмиды несовместимы (не могут существовать в одной клетке в виде отдельных плазмид), но в результате происходящей между ними рекомбинации образуется одна плазмида, объединяющая их функции. Затем аналогичным путем плазмиду NAH перенесли в штамм, несущий плазмиду XYL.Эти плазмиды совместимы и могут сосуществовать в одной клетке-хозяине. И наконец, гибридную плазмиду перенесли в штамм, несущий плазмиды NAH и XYL. В результате всех этих манипуляций получили штамм, который растет на неочищенной нефти лучше исходных штаммов, взятых по отдельности или вместе.
Хотя сам этот штамм не использовали для ликвидации нефтяных загрязнений, он сыграл важную роль в становлении биотехнологиче-
280 глава 13
 | Рис. 13.4. Путь мета-расщепления при ферментативном превращении катехола и протокатехоата в пируват и ацетальдегид. |
ской промышленности. Изобретатель «супербациллы» получил патент США, описывающий структуру данного штамма и возможности его применения. Это был первый патент, выданный за создание генетически модифицированного микроорганизма и подтвержденный Верховным судом США, который проиллюстрировал, что биотехнологические компании могут защищать свои изобретения точно так же, как химические и фармацевтические.
Большинство разрушающих ксенобиотики бактерий, модифицированных путем переноса плазм ид, являются мезофильными микроорганизмами (хорошо растут при 20—40 °С), а температура воды в загрязненных реках, озерах и океанах обычно лежит в диапазоне от 0 до 20 °С.
Биодеградация и утилизация биомассы 281
 |
| Рис. 13.5. Создание бактериального штамма, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин. Штамм А, несущий плазмиду САМ (она детерминирует разрушение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (разрушение октана). При этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологичной рекомбинации между исходными плазмидам и и обладающую функциями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду XYL (разрушение ксилола), скрешивают со штаммом D. содержащим плазмиду NAH (разрушение нафталина), и получают штамм F, который несет обе эти плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы E и F, в результате чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, XYL и NAH. |
Чтобы проверить, можно ли создать бактерию, обладающую более широкими катаболическими возможностями и в то же время способную расти и развиваться при низких температурах, плазмиду TOL (детерминирует разрушение толуола) мезофильного штамма Pseudomonas putida перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (с низким температурным оптимумом) штамм, утилизирующий салицилат при температуре, близкой к О °С. Трансформированный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собственную плазмиду SAL, детерминирующую разрушение салицилата, и был способен утилизировать как салицилат, так и толуол в качестве единственного источника углерода при 0°С (табл. 13.2). Психрофильный штамм дикого типа (нетрансформированный) не мог расти при любой температуре, если единственным источником углерода был толуол (толуат). Эта работа показала принципиальную возможность создания психрофильных штаммов бактерий, эффективно разрушающих ксенобиотики в природных условиях, но для их реального получения необходимо провести дополнительные исследования,
Изменение генов
Объединение разных метаболических путей в одном микроорганизме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Расширить их катаболические возможности можно идругим путем, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или
282ГЛАВА 13
| Таблица 13.2. Время генерации дикого и трансформированного психрофильных штаммов P. putida, использующих в качестве единственного источника углерода салицилат или толуат, при разных температурах1) | |||
| Температура, °С | Время генерации, ч | ||
| штамм дикого типа, салицилат2) | трансформированный штамм, салицинaт | трансфирмированный штамм, толуат | |
| Не растет | Не растет | Не растет | |
| 2,2 | 2,5 | 2,0 | |
| 2,1 | 3,2 | 1.3 | |
| 2,6 | 3,8 | 1,9 | |
| 3,2 | 4,2 | 2,9 | |
| 6,3 | 5,6 | 3,3 | |
| 13,9 | 12,9 | 12,2 | |
| 18,6 | 18,1 | 24.4 | |
| 1) Из работы Кolenc et al, Appl. Environ. Microbiol. 54:638 Ml, 1988, с изменениями. | |||
| 2) Штамм дикого типа не может утилизировать толуат ни при какой температуре, поскольку у него отсутствуют необходимые для этого ферменты. |
иного метаболического пути. Осуществимость этого подхода проверяли на примере плазмиды pWWO, 12 генов которой кодируют мета-расщепление толуола и ксилола. Обладающие этой плазмидой псевдомонады могут использовать в качестве источника углерода алкилбензоаты (рис. 13.6). Указанные гены входят в состав одного xyl-оперона, находящегося под контролем Pm-промотора. Транскрипционная активность последнего находится под позитивным контролем продукта гена xylS, активируемого почти всеми субстратами данного метаболического пути (например, бензоатом и 3-метилбензоатом) (рис. 13.6). Детальный биохимический и генетический анализ показал, что несущие pWWO-плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этилбензоат только до 4-этилкатехола, который инактивирует один из основных ферментов данного метаболического пути, катехол-2,3-диоксигеназу, являющуюся продуктом гена xylE, и поэтому не разрушается и накапливается в среде. Кроме того, 4-этилбензоат, в отличие от остальных алкилбензоатов, не активирует XylS-белок; поэтому, если он является единственным субстратом, xyl-оперон не транскрибируется. Для усовершенствования природной системы мета-расщепления алкилбензоатов необходимо решить две основные задачи: 1) предотвратить инактивацию катехол-2,3-диоксигеназы 4-этил-бензоатом; 2) индуцировать транскрипцию генов xyl-оперона в том случае, если единственным субстратом является 4-этилбензоат.
Для решения второй задачи был проведен поиск мутантной плазмиды. Для этого в плазми-ду, несущую ген устойчивости к ампициллину, встроили ген устойчивости к тетрациклину, находящийся под контролем Pm-промотора. В другую плазмиду, несущую ген устойчивости к ка-намицину, встроили ген xylS. Полученными конструкциями трансформировали E. соli, отобрали клетки, содержащие обе плазмиды, по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину (рис, 13.7, А), обработали их мутагеном этилметансульфонатом и вырастили на среде, содержащей тетрациклин и 4-этилбензоат. Растущие на этой среде клетки содержат мутантный ген xylS ипродуцируют измененный XylS-белок (S*), который способен взаимодействовать с 4-этилбензоатом и активировать транскрипцию гена устойчивости к тетрациклину. Чтобы решить проблему инактивации катехол-2,3-диоксигеназы, мутантный ген xylS встроили в плазмиду с широким кругом хозяев, несущую ген устойчивости к канамицину, и ввели ее в клетки P. putida, содержащие плазмиду pWWO (рис. 13,7, Б). Трансформированные клетки высеяли с высокой плотностью на чашки с минимальной средой, содержащей 4-этилбензоат в качестве единственного источника углерода, канамицин для отбора клеток с плазмидой и этилметансульфонат. Клетки, растущие на этой среде, вырабатывают измененную катехол-2,3-диоксигеназу, которая не ингибируется 4-этил-катехолом. Дополнительный анализ подтвер-
Биодеградация и утилизациябиомассы 283
 |
| Рис. 13.6. Путь мета-расщеплениятолуола и ксилола и хуl-оперон плазмиды pWWO. xyl-Oпepoннаходится под контролем Pm-промотора, который регулируется с помощью продукта гена xylS, в свою очередь активируемого одним из исходных субстратов. Гены xylX—xylH находятся под контролем Pm-промотора. Ген хуS невходит в состав оперона и экспрессируется конститутивно. Исходным субстратом может быть бензоат (R и R' — это Н), 3-метилбензоат (R — это H, R' — это СН3), 3-этилбензоат (R — это H, R' — это СН2СН3) и 4-метилбензоат(R — это СН3, R' — это Н). Гены xylXYZ кодируют толуолдиоксигеназу, xylL — дигидроксициклогексадиенкарбоксилатдегидрогеназу, xylE— катехол-2,3-диоксигеназу, xylF— гидролазу полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, xylG— дигидрогеназу полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, xylH — 4-оксалокротонат-таутомеразу, xyll — 4-оксалокротонатдекарбоксилазу, xylJ — 2-оксопента-4-еноатгидратазу, xylK—2-оксо-4-гидроксипентонатальдолазу. |
дил, что в гене катехол-2,3-диоксигеназы pWWO действительно произошла мутация и что два мутантных гена (xylS и ген катехол-2,3-диоксигеназы) обеспечивают расщепление 4-этилбензоата.
Оба модифицированных гена участвуют в процессе деградации всех субстратов данного метаболического пути. Поэтому стратегия, использованная для повышения эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соединений: мутация, приводящая к гиперпродукции XylS-белка, может усиливать активацию Рт-промотора и повышать скорость разрушения субстрата; кроме того, можно избирательно модифицировать Рm-промотор, чтобы он стал более сильным, сохранив способность взаимодействовать с XylS-белком. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического пути с помощью технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора.
Одним из наиболее распространенных веществ, загрязняющих почву и воду, является трихлорэтилен, широко использующийся в качестве растворителя и обезжиривающего средства. Он длительное время остается в окружающей среде и считается канцерогеном. Кроме того, анаэробные почвенные бактерии могут дегалогенировать его, превращая в еще более токсичное соединение винилхлорид.
Было показано, что некоторые штаммы P. putida, разрушающие ароматические соединения, такие как толуол, разрушают и трихлорэтилен. С помощью проведенных генетических исследований удалось установить, что для полной детоксикации трихлорэтилена не нужны все ферменты мета-расщепления ксилола и толуо-
284 ГЛАВА 13
Л  | Рис. 13.7. А. Создание системы синтеза XylS- белка, активируемого 4-этилбензоатом. Сначала заменяют промотор гена устойчивости к тетрациклину в плазмиде pBR322 Рт- промотором и получают плазмиду pJLR200. Затем ген xylS cсобственным промотором встраивают в плазмиду с широким кругом хозяев, несущую ген устойчивости к канамицину. Полученными плазмидами трансформируют E. coli. Отбирают трансформированные клетки по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину и подвергают мутагенному действию этилметансульфоната. В клетках, несущих мутантный ген xylS (S*), XylS-белок активируется 4-этилбензоатом (ЭБ), активируя в свою очередь Рm-промотор, поэтому они могут расти на среде, содержащей 4-этилбенэоат и тетрациклин. |
Биодеградация и утилизация биомассы 285