И других ветеринарных препаратов

Развитие сельскохозяйственного производства предусматривает использо­вание в ветеринарии некоторых антимикробных препаратов для профилактики и лечения скота и птицы. Однако в силу их недостаточной эффективности в ряде случаев производители несанкционированно применяют антибиотические ве­щества, используемые для лечения человека (производные пенициллина, тетра­циклина и левомицетина).

Применение таких препаратов может привести к последующему развитию устойчивой к данным веществам микрофлоры у человека, употребляющего в пи­щу продукты, содержащие антибиотики. У человека развивается дисбактериоз, и при назначении ему лечения антибиотиками велика опасность неэффективно­го лечения.

Возможность поступления таких мясных продуктов при импортировании, а также развитие собственного интенсивного животноводства и птицеводства делают проблему контроля весьма актуальной.

Во многих странах, в том числе в странах Евросоюза и России, примене­ние многих гормональных препаратов запрещено. Экономическая привлека­тельность применения химических стимуляторов требует жесткого контроля пищевой продукции на содержание остаточных гормонов. На основании дейс­твующих директив Европейского сообщества установлен и осуществляется сис­тематический контроль за остаточным содержанием гормональных препаратов в мясе и мясных продуктах (мясо скота и птицы) по ряду веществ (табл. 10).

Табл. 10. Допустимое содержание гормональных препаратов

Наименование	Объект контроля	Допустимый уровень содержания, мг/кг	Метод контроля
Тестостерон	Сыворотка крови	0,5	ГХ-МС, РИА, ВЭЖХ, ИФА
Эстрадиол 17р	Сыворотка крови	0,04	ГХ-МС, РИА, ВЭЖХ, ИФА
Метилтестостерон	Сыворотка крови, мясо	2,0 0	РИА, ИФА
Этинил эстрадиол	Мясо		ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
Тренболон	Мясо		ГХ-МС, РИА, ВЭЖХ, ИФА
Диэтилстилъбэстрол	Мясо, печень		ГХ-МС, РИА, ВЭЖХ, ИФА
Зеранол	Мясо		ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
Кленбутерол	Сыворотка крови, мясо, печень		ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
Дексаметазон	Мясо, печень, сыворотка крови	0,5 2,0	ГХ-МС, ВЭЖХ, ИФА
19-Нортестостерон	Мясо	1,0	РИА, ИФА
Гестагены	Жир		РИА, ВЭЖХ, ИФА
Тирео статики	Сыворотка крови	Не более 100	ГХ-МС, тех, ВЭЖХ,-1

14.7.1. Контроль за остаточным содержанием

антибиотиков и других ветеринарных препаратов

В странах Европейского сообщества потребители избегают покупать мясо и мясные продукты, полученные с использованием «гормональных» технологий и содержащие остатки гормональных препаратов даже в безопасных для здоро­вья концентрациях. Борьба за европейский рынок вынуждает многие животно­водческие предприятия отказываться от использования гормонов при выращива­нии скота.

К сожалению, в настоящее время в России предусмотрен только рекоменда­тельный, а не обязательный порядок контроля гормональных препаратов. В част­ности, согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 в продуктах животного происхождения контролируются остаточные количества стимуляторов роста животных, в том числе гормональных препаратов. Однако этот контроль основывается на инфор­мации, предоставляемой изготовителем (поставщиком) продукции, об использо­ванных при ее изготовлении и хранении стимуляторах роста животных и лекарст­венных препаратов. Таким образом, если недобросовестный поставщик скроет информацию о фактическом выращивании мяса по «гормональным» технологи­ям, возникнет опасность проникновения на российский рынок продукции, со­держащей гормональные препараты, так как в этом случае определение остаточ­ных количеств гормональных препаратов необязательно.

Развитие сельскохозяйственного производства предусматривает использо­вание в ветеринарии некоторых антимикробных препаратов для профилактики и лечения скота и птицы. Однако в силу их недостаточной эффективности в ряде случаев производители несанкционированно применяют антибиотические ве­щества, используемые для лечения человека (производные пенициллина, тетра­циклина и левомицетина).

Применение таких препаратов может привести к последующему развитию устойчивой к данным веществам микрофлоры у человека, употребляющего в пи­щу продукты, содержащие антибиотики. У человека развивается дисбактериоз, и при назначении ему лечения антибиотиками велика опасность неэффективно­го лечения.

Возможность поступления таких мясных продуктов при импортировании, а также развитие собственного интенсивного животноводства и птицеводства делают проблему контроля весьма актуальной.

Хлорамфеникол (левомнцетнн) — синтетический антибиотик широкого спектра действия, применение которого запрещено к использованию в живот­новодстве. Относительная дешевизна препарата и высокая антибактериальная эффективность приводят к его несанкционированному использованию в доста­точно широких масштабах, поэтому в мясе, печени, почках, молоке, твороге.

сметане, сыре, яйце и других продуктах довольно часто обнаруживаются ос­таточные количества левомицетина в концентрациях от 0,02-0,50 ед./г образца (1 ед. активности соответствует 1 мкг чистого вещества).

Тетрациклин является высокоэффективным антибиотиком широкою спект­ра действия и используется в медицине для лечения различных заболеваний, а так­же в ветеринарии из-за высокой прогиволгакробной эффективности (хлортетрацик-лин, окситетрациклин), что является небезопасным с точки зрения развития устой­чивости микрофлоры к данному антибиотику у человека, потребляющего в пищу продукцию, загрязненную тетрациклиналга. ПДК остаточного содержания антиби­отиков тетрациклиновой группы в мясных, молочных и других пищевых продуктах составляет 0,01 ед./г (у высокочистого тетрациклина 1 ед. соответствует 1 мкг).

В действующих на территории Российской Федерации требованиях к безо­пасности мясных продуктов остаточное содержание антибиотиков не допускает­ся и нормируется на уровне долей единицы антибиотической активности (мкг) в одном грамме образца (табл. 11).

Группа продуктов	Тетрацик-линовая грунна	Грозив	Баци гра­ции	Стрепто­мицин	Пеницил­лин	Низин
Мясо, шпик свежие и ох-
лажденные. Субпродукты	0,01	0,05	0,02	—	—	—
и продукты их переработки
Яйца и яйцепродукты	0,01			0,5
Молоко и кисломолочные	0,01	—	—	0,5	0,01	—
изделия, в том числе сухие
молочные изделия; сыры
и творожные изделия; масло
из коровьего молока; казеин
Молоко сгущенное	0,01	—	—	0,5	0,01

Таблица11. Содержание антибиотиков в 1 г образца

В настоящее время для аналитического определения остатков антибиотичес­ких препаратов используются микробиологические методы, основанные на регист­рации роста тест-культур микроорганизмов в присутствии стандартных количеств антибиотиков и анализируемых экстрактов; высокоэффективная жидкостная хро­матография; жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектирова­нием (ЖХМС); тонкослойная хроматография (ТСХ), позволяющая регистрировать появление индивидуального пятна анализируемого вещества; флуоресцентный анализ, основанный на образовании флуоресцирующего комплекса антибиотика со специальным органическим хромофором. Метод газовой хроматографии не ис­пользуют из-за сложности перевода антибиотиков в летучее состояние.

Следует отметить, что традиционное применение хроматографических и спектральных методов для анализа остаточных количеств ветеринарных препа­ратов позволяет решать задачу аналитического контроля качества, однако имеется ряд проблем. Во-первых, хроматографическая идентификация предусматривает анализ содержания конкретного вещества по времени удержания хроматографического пика. Известно значительное количество причин, по которым времена удержания могут варьироваться и даже совпадать для некоторых веществ. В слу­чае очень низких концентраций вешесгв зга особенность часто является нераз­решимой проблемой даже при использовании внутренних стандартов определяе­мых веществ. Ведущие производители хроматографического оборудования пред­лагают для надежной двойной идентификации вещества в установленном пике использовать, например, запись УФ-спектра или масс-спектра вещества с после­дующим сравнением со стандартной базой компьютерных данных. Такой подход к определению остаточного содержания опасных примесей в продовольственном сырье является достаточно надежным, но требует очень дорогостоящего аналити­ческого оборудования и не может быть рекомендован для серийного анализа.

С учетом требований, предъявляемых к экспресс-методам мониторинга продовольствия (чувствительность, селективность метода, скорость получения результатов, стоимость выполнения анализов), наиболее предпочтительным яв­ляется метод иммуноферментного анализа, в частности его разновидность - метод ELISA, удовлетворяюпщй всем требованиям, предьявляемым к методам рутинного контроля.

Основные принципы иммуноферментного анализа (ИФЛ) были пред­сказаны немецким ученым Полем Эрлихом на рубеже ХГХ-ХХ вв. Размышляя о механизме ф>чпсционирования защитных систем живото организма, он сфор­мулировал идею «антител», вырабатываемых организмом при проникновении в его ткани чужеродных объектов, названных «антигенами». Конкретный тип чу­жого обьекта и способ защитной реакции на вторжение могут быть установлены организмом в результате сверхспецифичного взаимодействия антител и антиге­нов, точно подходящих друг к другу, как ключ к замку. Впоследствии фундамен­тальные идеи, выдвинутые Эрлихом, были положены в основу радиоиммунного метода анализа, за разработку которого профессор физики и ядерной медицины Розалин Ялоу в 1977 г. получила Нобелевскую премию. К настоящему времени радиоиммунный метод анализа, предусматривающий использование радиоак­тивных изотопов и применение достаточно сложного оборудования, практичес Рассмотрим кратко упрощенную схему выполнения ИФА. Для анализа хи­мических соединений в пищевых и биологических объектах в основном исполь­зуется вариант «конкурирующего» иммуноферментного анализа, поэтому далее речь идет только об этом варианте ИФА, который называют также методом ELISA. Готовые наборы для ИФА в комплектной поставке производителя обыч­но включают все необходимые для выполнения анализа материалы, буферные и стандартные растворы. Антитела к тому или иному химическому соединению (антигену), полученные из сыворотки крови живых организмов, адсорбированы на твердую поверхность планшета, обычно на 96 лунок.

При контакте активированной поверхности носителя с раствором, содержа­щим антигены (например, левомпцетин), часть антител специфично взаимодейст­вует с молекулами контролируемого соединения, т. е. дезактивируется. В конку­рирующем варианте ИФА контролируемый раствор смешивают непосредственно в лунке планшета с раствором так называемою конъюгата, представляющего со­бой молекулы антигена, химически связанные (меченые) с молекулами фермента. В течение некоторого периода инкубации планшета (от 30 мин до 2 ч) при опре­деленной температуре антитела на поверхности носителя дезактивируются в ре­зультате итгуносорбции как меченых, так и немеченых антигенов.

После процедуры отмывки планшета, следующей за инкубацией, на поверх­ности носителя распределяются только сорбированные антигены, причем соотношение меченых и немеченых антигенов зависит от исходной концентрации антигенов в контролируемом растворе.

На стадии проявки в лунки планшета добавляют раствор так называемого субстрата. Фрагмент молекулы фермента, адсорбированной из раствора конъюгата вместе с меченым антигеном на поверхности лунки, катализирует хими­ческую реакцию превращения субстрата в окрашенное соединение. По окончании определенного времени развития данной цветной реакции в лунки планшета добавляют фиксирующий реагент и измеряют оптическую плотность содержимого каждой лунки. Поскольку одновременно с анализируе­мым раствором в некоторые лунки одного и того же планшета дозируются стан­дартные растворы, после измерения оптической плотности в лунках легко по­строить калибровочную кривую, по которой вручную или автоматически можно вычислить концентрацию контролируемого соединения в анализируемой пробе.

Применяемые аналитические метода определения содержания антибиотиков различаются по минимально определяемому уровню вещества в зависимости от свойств самого антибиотика (табл. 12).

Таблица 12. Минимальное детектируемое количество антибиотиков

Метод	Определяемое вещество	Предел обнаружения	пдк, не более	Время анализа, ч
TCX	Тетрациклин	0,1 мкг/г	0,01 ед./г
Флуориметрия	-» -	1 мкг/г	0,01 ед./г
ELISA	-» -	6 пг/г	0,01 ед./г
ELISA	Левомицетин	1 нг/г (мкг/кг)	0,01 мг/кг

Для аналитического определения сложных химических токсикантов пищевых продуктов используют методы, различающиеся по сложности и чувствительности. Наиболее удачное сочетание чувствительнос­ти, скорости и стоимости отличает иммуноферментный анализ, позволяющий до­статочно быстро проводить скрининг пищевой продукдии по максимальному чис­лу показателей. Стандартный хроматографический анализ методом тонкослойной, газожидкостной и жидкостной хроматографии уступает методу ELISA по простоте и минимально определяемому уровню анализируемого вещества. Метод ИФА поз­воляет определять содержание вредных примесей на уровне до 0,1 нг/мл.

Наиболее оправдано применение метода ИФА для определения сложных органических токсикантов, в частности гормонов и антибиотиков.