Кинетика ферменативного катализа. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента

4. Кинетика изучает влияние разных факторов на скорость реакции. Скорость ферментативной реакции (У) измеряют по убыли субстрата или приросту продукта за единицу времени.

5. Влияние концентрации фермента на скорость реакции: если концентрация субстрата постоянна, то скорость реакции пропорциональна концентра­ции фермента (рис. 2.11, а).

6. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции: график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имеет вид гиперболы (рис. 2.11, б), как, например, кривая насыщения миоглобина кислородом.

Измеряют скорость реакции почти сразу после начала реакции (начальную скорость) во избежание осложнений зависящих, например, от уменьшения концентрации субстрата, обратимости реакции или образования тормозящих реакцию продуктов.

Интервал времени, в течение которого скорость реакции равна начальной скорости или близка к ней, соответствует прямолинейному участку графика зависимости скорости реакции от времени (рис. 2.12).

При высокой концентрации субстрата, когда все молекулы фермента находятся в форме фермент-субстратного комплекса, достигается полное насыщение активных центров фермента субстратом, а скорость реакции становится максимальной (VMaKC).

При полунасыщении, когда половина молекул фермента находится в форме ES, скорость реакции равна половине максимальной (1/2 VMaKC). Концентрация субстрата, при которой достигается Vi VMaKC, дает численную величину константы Михаэлиса (4. Константа Михаэлиса Км и максимальная скорость реакции VMaKC — важные характеристики скорости при разных концентрациях субстрата, как указано на рис. 2.13.

VMaKC — величина, постоянная для каждого фермента, которая позволяет оценить эффективность его действия.

Км показывает сродство фермента к субстрату; чем меньше ее значение, тем больше сродство.

Изоферменты могут различаться по значению Км (для изоферментов глюкокиназы и гексокиназы значение Км различается в 50 раз, и это объясняет их различную физиологическую функцию; см. рис. 2.16).

Если реакция обратима, то взаимодействие фермента с субстратом прямой реакции характеризуется Км, отличающейся от таковой для субстрата обратной реакции (например, карбангидраза для С02 имеет Км, равную 1,2-10-2 М, а для НСО3-KM больше и равна 2,6-10-2 М).

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Простейшая схема ферментативного катализа включает обратимое образование промежуточного комплекса фермента (E) с реагирующим веществом (субстратом, S) и разрушение этого комплекса с образованием продуктов реакции (P):

Применение квазиравновесного приближения к этой схеме (при условии k2 << k-1) с учетом уравнения материального баланса [E] = [E]0 - [ES] (индекс "0" обозначает начальную концентрацию) позволяет выразить скорость образования продукта через начальную концентрацию фермента и текущую концентрацию субстрата:

где KS = k-1 / k1 = [E]. [S] / [ES] - субстратная константа. При увеличении концентрации субстрата скорость реакции стремится к предельному значению: wmax = k2. [E]0. Скорость реакции связана с максимальной скоростью соотношением:

(7.1)

Обычно в эксперименте измеряют зависимость начальной скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата: w0 = f([S]0). Проведение таких измерений для ряда начальных концентраций позволяет определить параметры уравнения (7.1) - KS и wmax.

Чаще всего для анализа кинетических схем ферментативного катализа используют метод стационарных концентраций (k2 >> k1). Применение этого метода к простейшей схеме катализа дает уравнение Михаэлиса-Ментен:

(7.2)

где wmax = k2. [E]0 - максимальная скорость реакции (при бесконечно большой концентрации субстрата),

- константа Михаэлиса. Эта константа равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной скорости. Типичные значения KM - от 10-6 до 10-1 моль/л. Константу скорости k2 иногда называют числом оборотов фермента. Она может изменяться в пределах от 10 до 108 мин-1.

Для практического определения кинетических параметров этот график неудобен, к тому же требует использования концентраций субстрата, «насыщающих» фермент, что не всегда достижимо при ограниченной растворимости субстрата. Поэтому обычно стремятся преобразовать уравнение Михаэлиса-Ментен в такую форму, чтобы графически оно изображалось прямой линией. Чаще всего для этого используют метод Лайнуивера-Берка, представляя уравнение Михаэлиса-Ментен в виде уравнения прямой линии:

Последнее выражение называют уравнением Лайнуивера-Берка и для расчета кинетических параметров используют график, построенный в координатах: 1/V против 1/S. В результате получается прямая, отсекающая на оси ординат отрезок, равный 1/V, а на продолжении оси абсцисс отрезок, равный - 1/Кга. Однако следует отметить, что при использовании графика Лайнуивера-Берка точки в области высоких концентраций субстрата располагаются слишком густо, а положение прямой линии во многом зависит от точек в области низких концентраций субстрата, где определение скорости менее надежно. Кроме того, реальные экспериментальные данные не всегда адекватно аппроксимируются в виде прямой линии:

3.Дезаминирование аминокислот-реакция отщепления α-аминогруппы от аминокислоты, в результате чего образуется соответствующая α-кетокислота (безазотистый остаток) и выделяется молекула аммиака. Аммиак токсичен для ЦНС, поэтому в организме человека и млекопитающих он превращается в нетоксичное хорошо растворимое соединение - мочевину. В виде мочевины, а также в виде солей аммония аммиак выводится из организма. Безазотистый остаток используется для образования аминокислот в реакциях трансаминирования,

Рис. 9-7. Судьба продуктов дезаминирования аминокислот.

в процессах глюконеогенеза, кето-генеза, в анаплеротических реакциях для восполнения убыли метаболитов ОПК, в реакциях окисления до СО₂ и Н₂О.

Существует несколько способов дезаминирования аминокислот:

• окислительное;
• непрямое (трансдезаминирование);
• неокислительное;
• внутримолекулярное.

Непрямое дезаминирование (трансдезаминирование)

Большинство аминокислот не способно дезаминироваться в одну стадию, подобно Глу. Аминогруппы таких аминокислот в результате трансаминирования переносятся на α-кетоглутарат с образованием глутаминовой кислоты, которая затем подвергается прямому окислительному дезаминированию. Такой механизм дезаминирования аминокислот в 2 стадии получил название трансдезаминирования, или непрямого дезаминирования:

Непрямое дезаминирование аминокислот происходит при участии 2 ферментов: аминотрансферазы (кофермент ПФ) и глутаматдегидрогеназы (кофермент NAD⁺).

Значение этих реакций в обмене аминокислот очень велико, так как непрямое дезаминирование - основной способ дезаминирования большинства аминокислот.Обе стадии непрямого дезаминирования обратимы (рис. 9-9), что обеспечивает как катаболизм аминокислот (рис. 9-9, А), так и возможность образования практически любой аминокислоты из соответствующей α-кетокислоты (рис. 9-9, Б).

В мышечной ткани активность глутаматдегидрогеназы низка, поэтому в этих клетках при интенсивной физической нагрузке функционирует ещё один путь непрямого дезаминирования с участием цикла ИМФ-АМФ. Вначале происходит перенос аминогруппы аминокислот на аспартат, затем на инозиновую кислоту (ИМФ) и в завершение - дезаминирование АМФ. Представленная схема отражает последовательность реакций непрямого неокислительного дезаминирования:

Можно выделить 4 стадии процесса:

• трансаминирование с α-кетоглутаратом, образование глутамата;
• трансаминирование глутамата с оксалоацета-том (фермент ACT), образование аспартата;
• реакция переноса аминогруппы от аспартата на ИМФ (инозинмонофосфат), образование АМФ и фумарата;
• гидролитическое дезаминирование АМФ.

Перенос аминогруппы от аспартата и синтез АМФ происходят следующим образом (см. схему А на с. 476).

Реакция дезаминирования адениловой кислоты происходит под действием фермента АМФ дезаминазы(см. схему Б на с. 476).

Рис. 9-8. Биологическая роль оксидазы D-аминокислот.

Рис. 9-9. Биологическая роль непрямого дезаминирования. А - при катаболизме почти все природные аминокислоты сначала передают аминогруппу на а-кетоглутарат в реакции трансаминирования с образованием глутамата и соответствующей кетокислоты. Затем глутамат подвергается прямому окислительному дезаминированию под действием глутаматдегидрогена-зы, в результате чего получаются а-кетоглутарат и аммиак; Б - при необходимости синтеза аминокислот и наличии необходимых а-кетокислот обе стадии непрямого дезаминирования протекают в обратном направлении. В результате восстановительного аминирования а-кетоглутарата образуется глутамат, который вступает в трансаминирование с соответствующей а-кетокислотой, что приводит к синтезу новой аминокислоты.

Схема А

Схема Б.

Этот путь дезаминирования преобладает в мышцах при интенсивной работе, в результате которой накапливается молочная кислота. Выделяющийся аммиак предотвращает закисление среды в клетках, вызванное образованием лактата.

ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА, фермент, катализирующий взаимопревращение L-глутаминовой и 2-оксоглутаровой к-т:

где НАДФ (НАД) и НАДФН (НАДН) соотв. окисленная и восстановленная форма кофермента никотинамидаденин-динуклеотидфосфата (никотинамидадениндинуклеотида) - акцепторы и переносчики электронов и водорода на промежут. стадиях. Относится к классу оксидоредуктаз.

Различают глутаматдегидрогеназы специфичные к НАД, НАД и НАДФ или только к НАДФ. В активном центре содержатся остатки лизина, тирозина и ци-стеина. Глутаматдегидрогеназа содержится в животных, растениях и микроорганизмах. В бактериях и синезеленых водорослях представлена одной формой, в др. организмах - неск. изоферментами.

Билет №21

1.Факторы транскрипции Факторами транскрипции называют белки или белковые комплексы, непосредственно не участвующие в каталитическом акте образования РНК, но необходимые для прохождения основных этапов транскрипции и ее регуляции. По функциональному признаку принято различать три класса факторов транскрипции.

К первому классу относятся основные факторы транскрипции, обеспечивающие нерегулируемый базальный уровень транскрипции и функционирующие в клетках всех типов.

Ко второму классу относятся факторы транскрипции, специфически взаимодействующие с определенными последовательностями ДНК, которые являются основными регуляторами транскрипции и обеспечивают тканеспецифическую экспрессию генов.

Третий класс факторов транскрипции (в том числе многочисленные TAF-белки) представлен белками - коактиваторами транскрипции, которые действуют согласованно с основными и тканеспецифическими факторами, обеспечивая более тонкую регуляцию транскрипции.

Транскрипционные факторы: Механизмы действия ТФ , связавающиеся с ДНК, могут влиять на транскрипцию генов через несколько механизмов:

1. В большинстве изученных к настоящему времени случаев ТФ стимулируют формирование комплекса преинициации на TATA- боксе - инициаторном элементе за счет взаимодействия их транс- активирующих доменов с компонентами базального транскрипционного комплекса (либо непосредственно, либо через коактиваторы/ медиаторы ).

2. Некоторые ТФ вызывают изменения структуры хроматина , делая его более доступным для РНК-полимераз .

3. Другие ТФ являются вспомогательными, создавая оптимальную конформацию ДНК для действия других транскрипционных факторов.

4. Известны ТФ, которые подавляют транскрипцию за счет непосредственного действия своих ингибирующих доменов , либо нарушая совместное функционирование комплекса транскрипционных факторов внутри регуляторной области гена ( промотора , энхансера ).

5. Наконец, имеются ТФ, которые сами не связываются с ДНК, а объединяются в более сложные комплексы посредством белок- белковых взаимодействий.

Обычно расматривают два уровния, на которых осуществляется регуляция транскрипции транскрипционными факторами:

Первый это сборка минимального транскрипционного комплекса , который является общим для множества генов и является субъектом для регуляции. Здесь факторы могут менять процесс сборки, упрочнять или ослаблять преинициационный комплекс PIC.

Второй уровень это сборка регуляторных комплексов , отдельных от PIC, которые взаимодействуют с минимальным комплексом и осуществляют его регуляцию, специфическую для гена или группы генов. Регуляция происходит путем изменения каталитической активности уже собранного траскрибирующего комплекса на стадиях инициации, элонгации или терминации.

Ковалентная модификация гистонов происходит по специфическим аминокислотным остаткам в N-треминальном хвосте. Многие из энзимов, участвующие в модификациях гистонов прежде всего действуют на гистоны H3 и H4. Эти модификации создают изменения в сродства гистонов к ДНК и др. ассоциирующим не-гистоновым белкам. Как результат эти модификации вносят вклад в конденсацию или реляксацию хроматиновых структур и те, в свою очередь предопределяют уровень экспрессии мРНК. Гистоновые модификации включают ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, poly ADP ribosylation, sumoylation и ubiquitination. Помимо энзимов, которые вносят специфические модификации, имеются также энзимы, такие как фосфатазы и гистоновые деацетилазы, которые их ревертируют.

Ацетилирование гистонов коррелирует с транскрипционной активностью, тогда как деацетилирование гистонов ассоциирует с молчанием генов. Интересно, что специфические сайты из аминокислотных остатков N-терминальных хвостах гистонов могут быть модифицированы по разному, создавая таким образом разнообразные комбинации, которые могут иметь разный эффект на конденсацию хроматина. Эти находки привели к гипотезе существования точного 'histone code', который вместе с метилированием ДНК управляет рекрутированием и сборкой транскрипционного преиниационного комплекса и контролирует транскрипционную элонгацию и возможно купированный с транскрипцией процессинг мРНК.

Негистоновые белки составляют около 20% от всех белков хроматина. Негистоновые белки - это все белки хроматина, кроме гистонов, выделяющиеся с хроматином или хромосомами. Это сборная группа белков, отличающихся друг от друга как по общим свойствам, так и по функциональной значимости. Около 80% из негистоновых белков относится к белкам ядерного матрикса, обнаруживаемых как в составе интерфазных ядер, так и митотических хромосом. Поскольку нет доказательств активной роли гистонов в процессе регуляции экспрессии гена у эукариотов, болем пристальное внимание было обращено на функцию кислых негистоновых белков хроматина. В пользу регулирующей роли этих белков в процессе активации генов свидетельствуют выраженный метаболический обмен, тканевая количественная и качественная специфичность, локализация на участках активной транскрипции ДНК и отсутствие на участках полной репрессии генов, возрастание их количества под влиянием факторов, индуцирующих функцию гена (например, под влиянием кортикостероидов). Негистоновые белки хроматина (НГБ) синтезируются в цитоплазме, а затем перемещаются в ядро НГБ связываются с ДНК неодинаково. Основным затруднением при исследовании функций НГБ является их значительное разнообразие, поскольку в состав НГБ входят ферменты и факторы транскрипции (главным образом РНК-полимераза), ферменты, необходимые для синтеза и распада белков, ферменты, видоизменяющие белки и нуклеиновые кислоты (метилирующие, ацетилирующне, фосфорилирующие), и даже сократительные белки в виде волокон актина.

2. Активность ферментов – способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в:

1) Международных единицах активности – (МЕ) количество фермента, катализирующего превращение 1 микромоля субстрата за 1 мин в стандартных условиях в расчете на 1 г ткани.

2) Каталах (кат) – количество катализатора (фермента), способное превращать 1 моль субстрата за 1 с. . Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с^–1 = 60 моль•мин^–1 = 60•10⁶ мкмоль•мин^–1 = 6•10⁷ U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин^–1 = (1/60) мкмоль•с^–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

3) Удельной активности – число единиц активности (любых из вышеперечисленных) в исследуемом образце к общей массе белка в этом образце. Отображает степень очистки фермента

4) Реже используют молярную активность – количество молекул субстрата превращенных одной молекулой фермента за минуту.

Активность зависит в первую очередь от температуры. Наибольшую активность тот или иной фермент проявляет при оптимальной температуре. Для Ф живого организма это значение находится в пределах +37,0 - +39,0 °С, в зависимости от вида животного. При понижении температуры, замедляется броуновское движение, уменьшается скорость диффузии и, следовательно, замедляется процесс образования комплекса между ферментом и компонентами реакции (субстратами). В случае повышения температуры выше +40 - +50 °С молекула фермента, которая является белком, подвергается процессу денатурации. При этом скорость химической реакции заметно падает. Активность ферментов зависит также от рН среды. Для большинства из них существует определенное оптимальное значение рН, при котором их активность максимальна. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов и для каждого из них существуют свои пределы опт рН, то изменение рН это один из важных факторов регуляции ферментативной активности. Так, в результате одной химреакции при участии определенного фермента рН опт которого лежит в перделах 7.0 – 7.2 образуется продукт, который является кислотой. При этом значение рН смещается в область 5,5 – 6.0. Активность фермента резко снижается, скорость образования продукта замедляется, но при этом активизируется другой фермент, для которого эти значения рН оптимальны и продукт первой реакции подвергается дальнейшему химическому превращению. (Еще пример про пепсин и трипсин)

3 ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ, синтез АТФ из аденозиндифосфата и неорг. фосфата, осуществляющийся в живых клетках, благодаря энергии, выделяющейся при окислении орг. в-в в процессе клеточного дыхания. Окислительное фосфорилирование протекает в спе-циализир. субклеточных структурах-митохондриях.

Митохондрии окружены белково-фосфолипидной мембраной. Внутри митохондрий (в т. наз. матриксе) идет ряд метаболич. процессов распада пищ. в-в, поставляющих субстраты окисления для окислительного фосфорилирования. Наиб. важные из этих процессов -трикарбоновых кислот цикл и т. наз. -окисление жирных к-т. Интермедиаты этих процессов подвергаются дегидрированию (окислению) при участии ферментов дегидрогеназ; затем электроны передаются в дыхат. цепь митохондрий-ансамбль окислит.-восстановит. ферментов, встроенных во внутр. митохонд-риальную мембрану. Дыхат. цепь осуществляет многоступенчатый экзэргонич. перенос электронов (сопровождается уменьшением своб. энергии) от субстратов к кислороду, а высвобождающаяся энергия используется расположенным в той же мембране ферментом АТФ-синтетазой, для фосфорилирования АДФ до АТФ. В митохондриальной мембране перенос электронов в дыхат. цепи и фосфорилирование тесно сопряжены между собой. Так, напр., выключение фосфорилирования по исчерпании АДФ либо неорг. фосфата сопровождается торможением дыхания (эффект дыхат. контроля). Большое число повреждающих митохондриальную мембрану воздействий нарушает сопряжение между окислением и фосфорилированием, разрешая идти переносу электронов и в отсутствие синтеза АТФ (эффект разобщения).

Механизм окислительного фосфорилирования можно представить схемой: Перенос электронов (дыхание) А ~ В АТФ А ~ В-высокоэнергетич. интермедиат Предполагалось, что А ~ В - хим. соед. с макроэргич. связью, напр. фосфорилир. фермент дыхат. цепи (хим. гипотеза сопряжения), или напряженная конформация к.-л. белка, участвующего в окислительном фосфорилировании (конформац. гипотеза сопряжения). Однако эти гипотезы не получили эксперим. подтверждения. Наиб. признанием пользуется хемиосмотич. концепция сопряжения, предложенная в 1961 П. Митчеллом. Согласно этой теории, своб. энергия транспорта электронов в дыхат. цепи затрачивается на перенос из митохондрий через митохондриальную мембрану на ее наружную сторону ионов Н⁺. В результате на мембране возникает разность электрич. потенциалов и разность хим. активностей ионов Н⁺ (внутри митохондрий рН выше, чем снаружи). В сумме эти компоненты дают трансмембранную разность электрохим. потенциалов ионов водорода между матриксом митохондрий и внеш. водной фазой, разделенными мембраной. Энергия , выделяющаяся при движении протонов внутрь митохондрий по электрич. полю в сторону меньшей их концентрации, используется АТФ-синтетазойдля синтеза АТФ. Т. обр., схему окислительного фосфорилирования, согласно этой концепции, можно представить в след. виде:Перенос электронов (дыхание) АТФ

Сопряжение окисления и фосфорилирования через позволяет объяснить, почему окислительное фосфорилирование, в отличие от гликолитич. ("субстратного") фосфорилирования, протекающего в р-ре, возможно лишь в замкнутых мембранных структурах, а также почему все воздействия, снижающие электрич. сопротивление и увеличивающие протонную проводимость мембраны, подавляют ("разобщают") окислительное фосфорилирование. Энергия , помимо синтеза АТФ, может непосредственно использоваться клеткой для др. целей - транспорта метаболитов, движения (у бактерий), восстановления нико-тинамидных коферментов и др.

В дыхат. цепи имеется неск. участков, к-рые характеризуются значит. перепадом окислит.-восстановит. потенциала и сопряжены с запасанием энергии (генерацией ). Таких участков, наз. пунктами или точками сопряжения, обычно три: НАДН: убихинон-редуктазное звено ( 0,35-0,4 В), убихинол: цитохром-c-редуктазное звено ( ~ ~ 0,25 В) и цитохром-с-оксидазный комплекс ( ~ 0,6 В)-пункты сопряжения 1, 2 и 3 соотв. Каждый из пунктов сопряжения дыхат. цепи м.б. выделен из мембраны в виде индивидуального ферментного комплекса, обладающего окислит.-восстановит. активностью. Такой комплекс, встроенный в фосфолипидную мембрану, способен функционировать как протонный насос.

АТФ-синтаза

АТФ-синтаза состоит из двух крупных фрагментов, обозначаемых символами F₁ и F₀. Первый из них (фактор сопряжения F₁) обращён в сторону матрикса митохондрии и заметно выступает из мембраны. Он состоит из девяти субъединиц, представленных пятью типами белков. Полипептидные цепи трёх субъединиц α и стольких же субъединиц β уложены в похожие по строению белковые глобулы, которые вместе образуют гексамер (αβ)₃. В центре этого гексамера находится субъединица γ, которая образована двумя протяжёнными полипептидными цепями. При этом нижняя часть субъединицы γ выступает в сторону мембранного комплекса F₀. Также внутри гексамера находится минорная субъединица ε, связанная с γ. Последняя (девятая) субъединица обозначается символом δ и расположена на внешней стороне F₁.

Мембранная часть АТФ-синтазы, называемая фактором сопряжения F₀, представляет собой гидрофобный белковый комплекс, пронизывающий мембрану насквозь и имеющий внутри себя два полуканала для прохождения протонов водорода. Всего в состав комплекса F₀ входит одна белковая субъединица типа а, две копии субъединицы b, а также от 9 до 12 копий мелкой субъединицы c. В молекуле АТФ-синтазы можно выделить две группы белковых субъединиц, которые могут быть уподоблены двум деталям мотора: ротору и статору. «Статор» неподвижен относительно мембраны и включает в себя шарообразный гексамер (αβ)₃, находящуюся на его поверхности и субъединицу δ, а также субъединицы a и b мембранного комплекса F₀. Подвижный относительно этой конструкции «ротор» состоит из субъединиц γ и ε, которые, заметно выступая из комплекса (αβ)₃, соединяются с погружённым в мембрану кольцом из субъединиц c.

Способность синтезировать АТФ — свойство единого комплекса F₀F₁, сопряжённого с переносом протонов водорода через F₀ к F₁, в последнем из которых как раз и расположены каталитические центры, осуществляющие преобразование АДФ и фосфата в молекулу АТФ. Движущей же силой для работы АТФ-синтазы является протонный потенциал, создаваемый на внутренней мембране митохондрий в результате работы цепи электронного транспорта.

Каталитическая активность АТФ-синтазы непосредственно связана с вращением её «ротора», при котором поворот субъединицы γ вызывает одновременное изменение конформации всех трёх каталитических субъединиц β, что в конечном счёте и обеспечивает работу фермента. Непосредственная функция синтеза АТФ локализована на β-субъединицах сопрягающего комплекса F₁. Самым первым актом в цепи событий, приводящих к образованию АТФ, является связывание АДФ и фосфата с активным центром свободной β-субъединицы, находящейся в состоянии 1. За счёт энергии внешнего источника (тока протонов) в комплексе F₁ происходят конформационные изменения, в результате которых АДФ и фосфат становятся прочно связанными с каталитическим центром (состояние 2), где становится возможным образование ковалентной связи между ними, ведущей к образованию АТФ. На данной стадии АТФ-синтазы ферменту практически не требуется энергии, которая будет необходима на следующем этапе для освобождения прочно связанной молекулы АТФ из ферментативного центра. В результате энергозависимого структурного изменения комплекса F₁ каталитическая β-субъединица, содержащая прочно связанную молекулу АТФ, перешла в состояние 3, в котором связь АТФ с каталитическим центром ослаблена. В результате этого молекула АТФ покидает фермент, а β-субъединица возвращается в исходное состояние 1, благодаря чему обеспечивается цикличность работы фермента.

Билет№22

1.Собственно трансляция происходит в рибосомах и включает три стадии:

1. Инициация: образование инициирующего комплекса, который включает метионин-тРНКи (инициирующая), мРНК и рибосомальные белки. Комплекс состоит из 40S и 60S субъединиц, объединенных в 80S-рибосому. Целостная рибосома имеет аминоацильный (А-сайт) и пептидильный участок (Р-сайт). Первый отвечает за связывание аминоацил-тРНК, а второй – за связывание растущей полипептидной цепи.

В состав инициирующего комплекса входит мРНК, которая на 5’-конце имеет 7-метилгуанозиновый «кэп». Начиная с кэпа, рибосома движется по мРНК и сканирует один кодон за другим, пока не наткнется на инициирующий (стартовый) кодон AUG. мРНК ориентируется таким образом, чтобы напротив пептидильного сайта рибосомы размещался инициирующий кодон AUG (кодирует метионин). Инициирующая метиониновая тРНК (мет-тРНКи) поставляет в рибосому первую аминокислоту – метионин, который становится N-концевой аминокислотой для большинства эукариотических белков (у прокариот это формилметионин). Для формирования инициирующего комплекса необходимо присутствие фактора eIF2 и более десяти других факторов инициации трансляции (eIF1, eIF3, eIF4, eIF6 и других). Роль факторов инициации различна. Так, фактор eIF3 препятствует объединению субъединиц рибосом в отсутствии мРНК; фактор eIF2 распознает инициирующую мет-тРНКи и поставляет энергию для инициации, расщепляя ГТФ; фактор eIF4A раскручивает мРНК и позволяет рибосоме двигаться по ней; фактор eIF4E распознает кэп. Благодаря взаимодействию между рРНК и мРНК последняя правильно фиксируется на рибосомных частицах, что способствует инициации.

2. Элонгация. Суть элонгации заключается в возникновении пептидных связей между остатками аминокислот с образованием полипептидной цепи, в которой последовательность аминокислот отвечает последовательности кодонов в мРНК. Элонгации нуждается в энергии ГТФ и факторах элонгации – EF1 и EF2.

Элонгация начинается после того, как мет-тРНКи займет пептидильний центр рибосомы. В свободный аминоацильний сайт рибосомы могут поступать любые аминоацил-тРНК, но остается в нем лишь та, антикодон которой комплементарен кодону на мРНК. В результате метионил-тРНК и вторая аминоацил-тРНК сближаются между собой, а пептидилтрансфераза (точнее пептидилтрансферазный центр), катализирует образование пептидной связи между ними. Заметим, что пептидилтрансферазный центр есть рибозимом и образуется как рибосомальной РНК (28S рРНК), так и белками большой субъединицы рибосом. После образования пептидной связи со второй аминокислотой высвобождается мет тРНКи и происходит транслокация (перемещение) образованного дипептида (дипептидил-тРНК) из аминоацильного сайта в пептидильный. Процессу нужна энергия ГТФ и фактор элонгации ЕF2. В результате транслокации освобождается аминоацильний сайт, в который поступает новая аа-тРНК, антикодон которой комплементарен очередному кодону на мРНК, а пептидилтрансфераза наращивает цепь белка еще на одну аминокислоту. Этот конвеер работает непрерывно до того момента, пока на мРНК не появятся терминирующие кодоны (UAA, UGA, UAG).

3.Терминация трансляции. Появление терминирующих кодонов на мРНК
способствует завершению трансляции, поскольку этим кодонам не отвечает ни одна из аа-тРНК. С этими кодонами связываются факторы терминации (eRF1 и eRF2), которые стимулируют гидролазную активность пептидильного центра. От новообразованного пептида отщепляется тРНК, и он отделяется от пептидильного центра. Рибосома диссоциирует на две субъединицы, а мРНК гидролизуется на свободные мононуклеотиды.

Полисомы (полирибосомы). В трансляции мРНК могут принимать участие несколько рибосом. Как только первая рибосома покидает инициирующий кодон на мРНК, он становится доступным для другой рибосомы и т.д. Поэтому на одну цепь мРНК может быть нанизано 5- 6 рибосом. Конвеерный характер трансляции существенно повышает скорость синтеза белка.

Ингибиторы трансляции у прокариот: стрептомицин блокирует стадию инициации; тетрациклин - связывание аминоацил-тРНК с рибосомами, хлорамфеникол - пептидилтрансферазную активность, эритромицин - процесс транслокации. Циклогексимид тормозит пептидилтрансферазную активность у эукариот, а пуромицин конкурирует с аминоацил-тРНК за аминоацильний сайт рибосомы. Ингибитором трансляции является дифтерийный токсин. А-фрагмент токсина имеет активность АДФ-рибозилтрансферазы и переносит АДФ-рибозу с НАД на фактор элонгации eEF2, инактивируя его. Интерфероны – белки, которые продуцируются лимфоцитами при заражении организма вирусами, активируют протеинкиназы, фосфорилирующие фактор инициации eIF2 и инактивируют его. Блокируется синтез вирусных и клеточных белков, наступает гибель инфицированных клеток, чем предупреждается распространение вируса.

ЦТК

Первая реакция ацетильная группа ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется лимонная кислота:

В результате второй реакции образовавшаяся лимонная кислота подвергается дегидратированию с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту (изоцитрат).

Третья реакция, по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса. Изолимонная кислота дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изо-цитратдегидрогеназы.

В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота одновременно декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg²⁺или Мn²⁺.

Во время четвертой реакции происходит окислительное декарбокси-лирование

Пятая реакция происходит образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ за счет высокоэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА:

В результате шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту.

Седьмая реакция гидратируется

8 реакция

Энергетический баланс 1 молекулы ацетил-КоА: 3НАДН = 9 молекул АТФ, ФАДН2 =2 молекулы АТФ, в реакции субстратного фосфорилирования обр. ГТФ = 1 АТФ. Итого обр. 12 молекул АТФ.

ЦТК выполняет следующие биохимические функции: Интергративная(обьеденяет катаболические пути углеводов, липидов и белков), амфиболическая (выполняет как катаболическую, так и анаболическую функции (все р-ции ЦТК), энергетическая (синтез АТФ), водорододонорная (генератор водорода для дыхательной цепи). Значение: цитрат участвует в синтезе ЖК, альфа-КГ участвует в образовании глутамата, пуриновых оснований, пролина и др., Сукцинил-КоА участвует в синтезе гемма, оксалоацетат – обр. аспарагин – пиримидиновые основания. , оксалоацетат- фосфорный пируват – серин, глицин, цистеин, триптофан. (анаболическая роль)

Как правило работа цикла Кребса не прерывается за счёт анаплеротических реакций, которые пополняют цикл субстратами: Пируват + СО₂ + АТФ = Оксалоацетат(субстрат Цикла Кребса) + АДФ + Фн.

3.Глицеролфосфатного челночного механизма. Цитоплазматический НАДН сначала реагирует с цитоплазматическим дигидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализируется НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой:Дигидроксиацетонфосфат + НАДН + Н+ <=> Глицерол-3-фосфат + НАД+. Образовавшийся глицерол-3-фосфат легко проникает через митохондриальную мембрану. Внутри митохондрии другая (митохондриальная)глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (флавиновый фермент) снова окисляетглицерол-3-фосфат до диоксиацетонфосфата: Глицерол-3-фосфат + ФАД <=> Диоксиацетонфосфат + ФАДН2.

Восстановленный флавопротеин (фермент-ФАДН2) вводит на уровне KoQ приобретенные им электроны в цепь биологического окисления и сопряженного с ним окислительного фосфорилирования, а диоксиацетонфосфат выходит из митохондрий в цитоплазму и может вновь взаимодействовать с цитоплазматическим НАДН + Н+. Таким образом, пара электронов (из одной молекулы цитоплазматического НАДН + Н+), вводимая в дыхательную цепь с помощью глицеролфосфатного челночного механизма, дает не 3, а 2 АТФ. В дальнейшем было показано, что с помощью данного челночного механизма лишь в скелетных мышцах и мозге осуществляется перенос восстановленных эквивалентов от цитозольного НАДН + Н+ в митохондрии.

В клетках печени, почек и сердца действует более сложная малат-аспартатная челночная система. Действие такого челночного механизма становится возможным благодаря присутствию малатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы как в цитозоле, так и в митохондриях. Установлено, что от цитозольного НАДН + Н+ восстановленные эквиваленты сначала при участии фермента малатдегидрогеназы переносятся на цитозольный оксалоацетат. В результате образуется малат, который с помощью системы, транспортирующей дикарбоновые кислоты, проходит через внутреннюю мембрану митохондрии в матрикс. Здесь малат окисляется в оксалоацетат, а матриксный НАД+ восстанавливается в НАДН + Н+, который может теперь передавать свои электроны в цепь дыхательных ферментов, локализованную на внутренней мембране митохондрии. В свою очередь образовавшийся оксалоацетат в присутствии глутамата и фермента Аспартатаминотрансфераза вступает в реакцию трансаминирования. Образующиеся аспарат и α-кетоглутарат с помощью специальных транспортных систем способны проходить через мембрану митохондрий.

Транспортирование в цитозоле регенерирует оксалоацетат, что вызывает к действию следующий цикл. В целом процесс включает легкообратимые реакции, происходит без потребления энергии, ≪движущей силой≫ его является постоянное восстановление НАД+ в цитозоле глицеральдегид-3-фосфатом, образующимся при катаболизме глюкозы.

Билет 23

1. Посттрансляционная модификация — это ковалентная химическая модификация белка после его синтеза на рибосоме. Для многих белков посттрансляционная модификация оказывается завершающим этапом биосинтеза, который является частью процесса экспрессии генов. Наряду с альтернативным сплайсингом посттрансляционные модификации увеличивают разнообразие белков в клетке.