Морфология и ультраструктура бактерий

Введение.Бактерии относятся к доминиону Bacteria. Они являются одноклеточными прокариотическими (доядерными) организмами. Бактериальная клетка обладает характерными

особенностями строения (ультраструктуры) и существенно от­личается от эукариотической.

Бактерии имеют микроскопические размеры, большинство — в пределах разрешающей способности светооптической микро­скопии (превышают 0,2 мкм), однако существуют и более мелкие формы.

Форма клетки относится к числу важных таксономических признаков бактерии. По форме клеток бактерии подразделяют на шаровидные, палочковидные, нитевидные и извитые (рис. 2.1).

Шаровидные бактерии — кокки (coccus — зерно) имеют правильную сферическую или эллипсоидную форму. Кокки могут образовывать характерные скопления, что обусловлено особенностями их деления и способностью дочерних клеток сохранять связь друг с другом после деления. Кокки могут располагаться беспорядочно (микрококки), парами (диплокок­ки), в виде цепочек из 3 и более кокков (стрептококки), в виде пакетов, состоящих из 4 (тетракокки) и 8 (сарцины) кокков, и в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь (стафи­лококки).

Диплококки и стрептококки образуются при делении в одной плоскости, если дочерние клетки могут не отходить друг от друга. Упорядоченное деление в 2 и 3 плоскостях приводит к образованию тетракокков и сарцин. При делении в разных плоскостях образуются стафилококки.

Палочковидные бактерии (бациллы) различаются по разме­рам, форме клеток и их концов, а также по расположению. Они могут быть тонкими, утолщенными на концах либо с обрубленными концами. Одни располагаются в виде одиноч­ных клеток, другие парами — диплобактерии, третьи в виде цепочек — стрептобактерии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палоч­ками, имеющими V4^- У2 завитка (вибрионы) или несколько (1—3) завитков (спириллы), и спиралевидными бактериями (спирохеты). Нитевидные и ветвистые формы характерны для актиномицетов.

Бактерии не имеют дифференцированного ядра. Нуклеоид бактерий — аналог ядра — не окружен мембраной и располага­ется в цитоплазме. Бактерии лишены внутриклеточных мем­бран и ограниченных ими органелл. Плазматическая мембрана (ПМ) является единственной мембраной, присущей всем бак­териальным клеткам. В цитоплазме бактерий свободно распо­лагаются рибосомы, могут также присутствовать включения и споры (рис. 2.2). Последние могут располагаться терминально, субтерминально и центрально. Снаружи от ПМ находится клеточная стенка (КС). По строению КС бактерии подраз­деляют на 2 группы: фирмикутные и грациликутные. КС может быть покрыта капсулой или капсулоподобной оболоч-

Рис.2.1. Формы бактерий. Рис.2.2. Споры бактерий,

а — шаровидные; б — палочковид- а — терминальное расположение; б —
ные; в — извитые. субтерминальное; в — центральное.

кой. Многие бактерии имеют внешние органеллы движения — жгутики (рис. 2.3). Реснички (фимбрии, пили), располагаю­щиеся на поверхности клетки, участвуют в прикреплении бак­терий к различным субстратам (адгезии) и друг к другу (коге-зии).

Для изучения морфологии и ультраструктуры бактерий при­меняют световую и электронную микроскопию.

Морфологию бактерий обычно изучают методом световой микроскопии фиксированных окрашенных препаратов. Для окрашивания бактерий применяют различные красители. Чаще

всего используют анилиновые
красители (метиленовый си­
ний, генциановый фиолето­
вый, малахитовый зеленый,
фуксин и др.). В основе ок­
раски лежат сложные хими­
ческие и физико-химические
реакции между красителем и
химическими соединениями в
составе бактериальной клетки.
При этом различные струк­
турные компоненты клетки
могут окрашиваться разными
красителями. Цитоплазма
(особенно в фиксированных
мазках) обладает сродством к
Рис.2.3. Жгутиковые бактерии. основным красителям (мети-
а — монотрих; б - лофотрих; в - леновый СИНИЙ, кристалли-

амфитрих; г — перитрих. ческий фиолетовый, везувин

и др.). Для выявления различных структур бактериальной клет­ки применяют нейтральные и кислые красители.

Различают простые и сложные методы окраски. Простые методы заключаются в окраске препарата одним красителем и позволяют изучать форму и размеры бактерий. Сложные мето­ды (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последова­тельное использование нескольких красителей и дополнитель­ных способов обработки препаратов. Тинкториальные свой­ства — способность воспринимать и удерживать красители — зависят от особенностей строения и химического состава бак­териальной клетки. Сложные методы окраски позволяют диф­ференцировать бактерии по этим признакам и имеют диагнос­тическое значение. Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных ком­понентов бактерий: жгутиков, капсул и разных цитоплазматичес-ких включений.

Методы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии дают возможность прижизненного изучения бактерий, в част­ности их подвижности. Для этого готовят нативные (прижиз­ненные) препараты.

Электронную микроскопию используют для изучения ульт­раструктуры (тонкой организации) бактерий.

Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

▲ План

▲ Программа

1. Морфология бактерий и методы ее изучения.

2. Подвижность бактерий и методы ее изучения.

3. Простые методы окраски препаратов.

4. Определение размеров бактерий.

а Демонстрация

1. Приготовление мазков из бактериальных культур.

2. Красители, используемые в микробиологии.

3. Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.

▲ Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окра­шенные простым методом (стафилококки, стрепто­кокки, сарцины, палочки, стрептобациллы).

2. Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жид­кой и плотной питательных средах.

3. Окрасить мазки простым методом.

4. Микроскопировать и дифференцировать бактерии в

мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.

Методические указания

Приготовление препаратов для микроскопического исследова­ния.Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях исполь­зуют препаровальные иглы.

Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ееV и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю впробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают мате­риал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пла­мени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно наби­рать пипеткой.

Приготовление нативньгх препаратов для прижизненного изу­чения микроорганизмов.Метод "висячей" капли. Пре­парат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном пре­парате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объек­тив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и ис­следуют препарат. Определяют подвижность бактерий.

Метод "раздавленной" к а п л и. На поверхность обез­жиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь мик­роорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.

После микроскопии препараты "раздавленной" или "вися­чей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков.Для при­готовления препарата на обезжиренное предметное стекло на­носят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из

жидкой питательной среды, то материал непосредственно на­носят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю, воды, или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуе­мый материал и готовят взвесь. При правильном распределе­нии материала в мазке при микроскопии видны изолирован­ные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.

Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло про­водят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).

Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют по­гружением на 5—20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Окраска препаратов простым методом.Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фук­сином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии.Для люминесцентной микроскопии на предмет­ных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флю­оресцентными красителями: акридиновым желтым, акридино­вым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии.Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницае­мо для электронов. Исследуемый объект максимально очища­ют от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую се­точку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).

Измерение микробных клеток.Измерение микробов осущест­вляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют оку­ляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр слу­жит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эта­лонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы

известна и указана на стекле. Обычно каждое деление шкалы объект-микрометра равно 10 мкм.

Микроорганизмы измеряют окуляр-микрометром, предва­рительно определив цену его делений с помощью объект-мик­рометра. Для этого объект-микрометр устанавливают на пред­метном столике микроскопа и, вращая винтами для перемеще­ния столика, добиваются, чтобы одно из его делений совпало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Затем отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью ук­ладывается число делений окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), устанавливают величину деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометр заменяют исследуемым препаратом и определяют размеры бак­териальной клетки линейкой окуляр-микрометра при той же степени увеличения, при которой была измерена величина его делений.

Для измерения микроскопических объектов используют сле­дующие метрические единицы: 1 микрометр (мкм) = Ю^-3 мм, 1 нанометр (нм) = 10~° мм.

Результаты изучения бактериальной культуры протоколиру­ют, как показано в табл. 2.1.1.

Таблица 2.1.1. Характеристика культуры по морфологическим и тинк-ториальным признакам (форма протокола)

Наши рекомендации

Форма	Разме­ры	Окраска по мето­ду Грама	Наличие	Кислото- устоичи- вость	Под-
клеток	спор	кап­сул	зерен волю-тина