Диализатор в рабочем состоянии

Приложение 1.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ.

Лабораторная работа №1.

Определение белка в сыворотке крови биуретовым методом.

Реактивы. Биуретовый реактив, или реактив Бенедикта (173г цитрата натрия и 100г карбоната натрия растворяют в 300 мл дистиллированной воды на водяной бане. Отдельно в 300 мл воды растворяют 17,3 г сульфата меди. Оба раствора сливают и доводят общий объем до 1 л); хлорид натрия, 0,9%-ный раствор.

Оборудование. Микропипетки и пипетки вместимостью 1 и 5 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; фотоэлектроколориметр (ФЭК); спектрофотометр (СФ).

Материалы. Сыворотка крови; альбумин, 10%-ный раствор.

Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu2+ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде.

Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.

Схема разведения альбумина для построения калибровочного графика приведена в таблице:

№ пробирки	Стандартный 10%-ный раствор альбумина, мл	0,9%-ный раствор хлорида натрия, мл	Концентрация белка, г/л	Экстинкция
	0,4	0,6
	0,6	0,4
	0,8	0,2
	1,0	-

Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый).

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка.

Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой.

Оформление работы. По калибровочной кривой рассчитать содержание белка. Сделать вывод о наличии отклонения концентрации белка в исследуемой сыворотке крови от нормы и о возможных его причинах.

Практическое значение работы. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическим свойствам (более 100 различных белков плазмы крови). Нормальное содержание белка в сыворотке крови (нормопротеинемия) составляет 65-85 г/л. Определение общего белка в сыворотке крови находит широкое применение в практической медицине, так как по изменению его нормального содержания можно судить о различных нарушениях в организме. Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) относительно редко: при сгущении крови из-за потери жидкости (длительная рвота, усиленное потоотделение, холера, тяжелые ожоги и т.п.), при некоторых хронических воспалительных процессах вследствие образования антител (ревматизм, полиартрит). Пониженное содержание белка в крови (гипопротеинемия): при недостаточном поступлении белка с пищей (голодание, нарушение проходимости кишечного тракта), при нарушении образования белка в органах (при поражении печени химическими веществами, опухолями, микроорганизмами и т.д.), при потере белка организмом (кровотечения, повышенная проницаемость сосудов, заболевания почек, беременность и т.д.).

В фармацевтической практике количественные методы определения белка необходимы для контроля белковых лекарственных средств (вакцин, сывороток, γ-глобулина, белковых препаратов крови и т.д.).

Лабораторная работа №2.

Диализ белков.

Диализ демонстрирует макромолекулярную природу белка. Как и все высокомолекулярные соединения, белок не проникает через искусственные (например, целлофан, пергамент и др.) и биологические мембраны, что позволяет использовать диализ как метод очистки белка от низкомолекулярных органических и неорганических примесей. С этой целью применяется специальный прибор – диализатор (или электродиализатор). Простейший из них представляет собой сделанный из целлофана или другого подобного ему материала мешочек, наполненный раствором очищаемого белка и погруженный в стакан с дистиллированной водой.

Реактивы. Сульфат аммония, насыщенный раствор; хлорид бария, 5%-ный раствор; биуретовый реактив.

Оборудование. Целлофан, предварительно разрезанный на куски размером 125х125 мм (можно применять заводской диализаторный материал); стакан с дистиллированной водой; стеклянные палочки; резиновые колечки; штатив с пробирками; пипетки.

Материал. Раствор яичного белка (приготовление см. работу 1) или сыворотка крови.

Метод основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Ход определения. К 5 мл раствора яичного белка (или сыворотки крови) добавляют каплю насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Отбирают в две пробирки по 10 капель раствора и проделывают в одной из них биуретовую реакцию, а в другой – пробу на сульфаты. При проведении пробы на сульфаты добавляют 2-3 капли раствора хлорида бария.

Целлофану, предварительно замоченному в дистиллированной воде, придают форму мешочка, который примерно на 1/3 заполняют исследуемым раствором белка. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, которые прижимают друг к другу с помощью надетых с двух концов резиновых колечек.

Мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой, положив зажимающие его стеклянные палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке не должен быть выше уровня жидкости в стакане (рис.1).

Диализатор в рабочем состоянии

Через час после начала диализа берут две пробы (по 10 капель) наружной жидкости (диализат). С одной стороны, из них проводят биуретовую реакцию на белок, а с другой – реакцию на сульфаты, добавляя 2-3 капли хлорида бария.

Проделывают пробы на белок и сульфаты с жидкостью внутри мешочка.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отметив знаками «плюс» или «минус» наличие реакции:

Определяемые компоненты	До диализа	После диализа
внешняя жидкость	внутренняя жидкость	внешняя жидкость	внутренняя жидкость
Белок SO42-

В выводах отметить, какое свойство белка демонстрирует метод диализа и возможность его применения.

Практическое значение работы. Метод анализа используется для отделения низкомолекулярных органических примесей и неорганических ионов при очистке белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.д. в биохимических исследованиях или при получении лечебных препаратов (например, белковых). Способ диализа положен в основу работы аппарата «искусственная почка», который применяется для очищения крови от природных низкомолекулярных «шлаков» и токсических соединений.