Стадии получение рекомбинантных ( гибридных ) молекул ДНК

1. Получение исходного генетического материала – гена , кодирующего интересующий белок( признак)

· Необходимый ген может быть получен двумя способами : искусственный синтез или выделение природных генов

· Искусствееный синтез генов вне организма возможен двумя способами :

q Ферментативный синтез - « вырезание » необходимого гена из донорской ДНК клеток интересующего организма с помощью специальных ферментов – рестиктаз

v Рестриктазы – ферменты , относящийся к классу гидролитических ферментов ( гидролаз ) , а именно к группе нуклеаз или эндонуклеаз – ферментам гидролизующим связи нуклеиновых кислот ( ДНК и РНК ) внутри полимерной цепи по строго определённым последовательностям нуклеотидов ; в настоящее время известно около 500 рестриктаз , специфичных к определённым триплетам

v Каждая рестриктаза режет молекулу ДНК только в том месте , где находится определённый триплет , который она может узнавать из множества других ; в результате двойная нить ДНК разделяется на участки ( гены )

v При разделениии ДНК образуются её фрагменты ( гены ) , имеющие однонитевые , так называемые « липкие концы » , имеющие комплементарные основания , которые в присутствии другого фермента могут соединяться ( слипаться ) с комплементарными им « липкими » концами другой ДНК , предварительно разрезанной рестриктазами

v Рестриктаза узнаёт свой триплет в молекуле ДНК любого происхождения – будь то одноклеточные организмы , растения , животные или человек , поэтому образованные липкие концы у молекул ДНК ( генов ) разного происхождения будут оканчиваться на одинаковые триплеты и способны комплементарно соединятся

q Химический

а ) искусственный синтез гена in vitro из отдельных нуклеотидов ( впервые синтезирован индийцем Г. Кораной в 1970 году )

б ) копирование соответствующих матриц РНК ( при этом используется фермент обратная транскриптаза , катализирующий реакции синтеза ДНК на м-РНК )

v Из клеток выделяют и-РНК , являющуюся транскрипционной копией нужного гена , и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК ; затем и-РНК , спаренную с цепью ДНК , уничтожается специальным ферментом , а оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной второй цепи ДНК ; получившаяся двойная спираль ДНК называется к-ДНК ( комплементарная ДНК ) и является искомым геном ( к-ДНК не имеет интронов как все бактериальные гены )

v Искусственно синтезированы гены глобина человека , кролика , голубя , гены синтеза человеческого инсулина и сомато статина , гены митохондрии печени крыс и др.

2. Выделение ДНК - вектора и его рестрикция ( разрезание )

· Вектор – фрагмент ДНК , с помощью которого осуществляется перенос какого-либо гена в клетку - хозяина

· В качестве вектора используют плазмиду или вирус

v Плазмиды – мелкие кольцевые двуцепочечные молекулы внехромосомной ДНК в клетках прокариот ( бактерий ) ; как правило несут гены , контролирующие признаки не связанные с жизненно важными функциями и способные самосотоятельно реплицироваться ; при создании определённых условий в одной клетке можно получить тысячи копий плазмид ; плазмиды способны проникать в другие клетки , преодолевая их мембраны

· Плазмиду ( векторную кольцевую ДНК ) разрезают ( рестрикциируют ) в одной точке , превращая её из кольцевой структуры в линейную

Рестрикция – разрезание ДНК рестрикционной эндонуклеазой на фрагменты с « липкими » концами

· У обоих молекул ДНК , т.е. у плазмиды и выделенного гена получены одинаковые липкие концы , вследствие использования одного вида рестриктаз

3. Смыкание выделенного гена с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК - лигирование

Лигирование – соединение фрагмента ДНК ( гена ) с ДНК плазмиды ферментом лигазой с образованием кольцевой рекомбинантной ДНК ( вектора-плазмиды )

· Воссоединение плазмиды и с выделенным геном происходит в отдельной пробирке благодаря имеющимся на их липких концах комплементарных азотистых оснований

· Выделенный ген встраивается ( « вшивается » ) в место разреза плазмиды , а липкие концы замыкают линейную молекулу в кольцо ; в результате образуется вектор , представляющий уже рекомбинантную молекулу ДНК ( молекулу ДНК , содержащую инородный ген , называют ещё химерной молекулой )

· Чтобы сомкнуть выделенный ген с ДНК-вектора , используют ферменты – лигазы ( ДНК – лигаза которые помогают липким концам соединиться

v Лигазы – класс ферментов , катализирующих реакции присоединения двух различных молекул ДНК друг к другу , а также восстановление её нормальной структуры после частичного повреждения

3. Трансформация или трансгенез – введени рекомбинантных плазмид-векторов в обработанные бактериальные клетки

· Вектор-плазмида ( рекомбинантная ДНК ) используется в качестве переносчика встроенного в него гена в клетку другого организма ( бактериальную или животную клетку-реципиент ) , где на его основе будет осуществляться синтез белка по технологии микробиологического синтеза ( являясь молекулой ДНК плазмида-вектор может успешно работать в клетке-реципиенте , когда в неё встроены чужие гены , изъятые из клеток растений , животных и даже человека ; такие клетки и организмы называются трансгенными или химерными )

v Наиболее часто в качестве клетки-реципиента используется клетки кишечной палочки Е . coli или дрожжей ; начинается молекулярное клонирование – получение колонии бактериальных клеток , содержащих молекулу рекомбинантной ДНК и синтезирующих заданный белок ( все потомки трансфомированной бактерии называются клоном ) ; с помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого необходимого гена человека или другого высшего организма

v С целью повышения проникновения рекомбинантных молекул ДНК в клетки их подвергают кратковременному воздействию сильного электического тока , которое создаёт полости в мембранах и делает их на короткое время проницаемыми

v Трансформированные бактерии вместе высевают на питательную среду ( агар – агар ) , на которой они размножаются , образуя клониальные колонии

Скрининг – отбор среди колоний - клонов трансформированных бактерий , содержащих рекомбинантную ДНК

v Так создаются новые высокопродуктивные штаммы бактерий или соматических клеток , синтезирующих белки , имеющие коммерческую ценность , которые передаются в микробиологическую промышленность

v Сегодня накапливаются клонированные гены ДНК тканей человека иряда сельскохозяйственных животных и растений ( в том числе и раковых клеток ) ; коллекцию разных клонов называютклонотекой , геномной библиотекой или банком генов ; для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов ; процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован

· Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовую изоляцию и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим

Достижения генной инженерии

· Введение генов эукариот в бактерии используется для микробиологического синтеза биологически активных веществ , которые в природе синтезируются только клетками высших организмов

· Синтез гормонов , всегда содержащихся у животных и человека в ничтожных количествах , но абсолютно необходимых для лечения широко распространённых патологий ; их химический синтез очень трудоёмкий и дорогой , поэтому был синтезированы гены , которые кодируют синтез этих гормонов , сконструирован рекомбинантный организм , в состав генома которого входит запрограммированный ген , способный осуществлять синтез полноценного человеческого гормона

q Таким образом в ряде стран , в том числе и России , получают ряд гормонов ( инсулин , гормон роста – соматотропин ) и интерферон – универсальный природный фактор для борьбы с вирусными инфекциями

v Гормон роста человека – соматотропин вырабатывается в гипофизе и контролирует рост человеческого тела ; его недостаток приводит к карликовости , соматотропин – единственное средства лечения детей , страдающих карликовостью из-за недостатка этого гормона ; до развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов ; с 1980 года соматотропин синтезируется в специально сконструированных клетках Е . coli ( кишечной палочки ) , он доступен в больших количествах , его препараты биохомочески чисты и свободны от вирусных загрязнений

v Инсулин – гормон поджелудочной железы , регулирующий уровень сахара в крови и клетках получали раньше из поджелудочных желёз забиваемых свиней и коров , что обеспечивало инсулином только около 7 % больных сахарным диабетом во всём мире ; с 1982 года этот гормон получают в промышленных масштабах из бактерии Е . coli ,содержащих ген человеческого инсулина

· Перенос генов в растения – желаемые гены выделяются в чистом виде , а затем с помощью агробактерий вводятся в геном растений , что значительно повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам , продуктивность , сохранность и транспортабельность( трансгенные полиплоидные формы бобовых – сои , паслёновых , овощных , зернорвых , фруктовых , ягодных , кормовых растений )

· Синтез генов гормонов роста и генов , связанных с молочной продуктивностью , и их последующее введение в организм сельскохозяйственных животных , что позволяет получить новые породы животных с повышеннй продуктивностью ( ген , кодирующий синтез гормона роста у крупного рогатого скота , введённый в геном свиней приводит к появлению особей весом более 500 килограмм )

v Метод заключается во введении гена в яйцеклетку животного ; полученное от такой яйцеклетки потомство будет содержать повышенное количество требуемого гена во всех клетках организма

Трансгенные организмы ( растения и животные ) – это организмы , геном которых изменён в результате генно-инженерного внедрения в него несвойственного им гена ( рекомбинантной ДНК )