Приложение к занятию 4

А. Иерсинии - возбудители псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) и кишечного иерсиниоза (Y.enterocolitica)

Эти два вида иерсиний играют значительную роль в патологии че­ловека. Бактерии представляют собой полиморфные, не образующие спор грамотрицательные палочки, имеющие часто овоидную форму. Клетки в старых культурах окрашиваются неравномерно. Бактерии псевдотуберкулеза, взятые с влажного агара, могут иметь биполярную окраску, об­разуют капсулу, но с различной степенью выраженности. Оба вида бак­терий обладают подвижностью, обусловленной наличием перитрихиальных жгутиков. Подвижность выявляется посевом в столбик полужидкого агара уколом, но только при 18-20º , при 37° подвижность отсутствует.

Иерсинии неприхотливы к питательным средам, хорошо растут на обычных универсальных средах, способны активно размножаться в почве и воде. Оптимальная для роста температуре 30º С, верхняя и нижняя границы роста составляют 43° С и 0-2° С соответственно, оптимум рН 6,6-7,8. На среде Эндо колонии имеют диаметр 0,1-0,2 мм, круглые вы­пуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные (не ферментируют лак­тозы). Колонии возбудителя псевдотуберкулеза, находящиеся в R-форме, почти не отличаются от колонии возбудителя чумы (пигментированный центр и фестончатый "кружевной" край). Биохимические различия трех видов иерсиний представлены в таблице.

Все три вида иерсиний отличаются и по своим антигенным свой­ствам.

Возбудитель псевдотуберкулеза по 0-антигенам разделяется на восемь групп (1-8) с 20 0-факторными антигенами (1-20). По 0-и Н-антигенам (а-е) этот вид подразделяют на 13 сероваров и подсероваров (la, 1в, 2а, 2в, 2с, 3, 4а, 4в, 5а, 5в, 6, 7, 8).

Иерсиния энтероколитика характеризуется антигенной неоднород­ностью по 0-антигену. В настоящее время различают более 30 сероваров этого вида. Большинство из них адаптированы к некоторым видам животных или широко распространены во внешней среде. Подавляющее большинство штаммов, выделенных от человека, принадлежат к сероварам 03 и 09, реже встречаются серовары 08, 05в и очень редко - серовары 01, 02, 06, 07, 010, 011, 013, 014, 015, 016, 017.

От людей, больных псевдотуберкулезом, чаще всего выделяются штаммы, относящиеся к Серовару 1, реже 3 и 4.

В ходе эволюции у иерсиний закрепилась необходимость существо­вания в двух средах обитания - внешней (сапрофитическая фаза жизни) и в организме теплокровных животных и человека (паразитическая фаза). Для осуществления паразитической стадии иерсинии должны проникнуть в организм теплокровного животного. Заражение возбудителем псевдо­туберкулеза чаще всего происходит при употреблении в пищу инфициро­ванных иерсиниями продуктов, хранившихся при пониженной температу­ре (4-12ºС) в холодильниках и овощехранилищах. В этих условиях бак­терии в силу своей психрофильности могут размножаться и накаплива­ться в пищевых субстратах.

Иерсинии при пониженной температуре обладают высоким потенциа­лом клеточной и тканевой инвазивности и способны сохранять высокий уровень вирулентности, однако возбудитель может проникнуть в орга­низм человека и через любые слизистые оболочки, вероятно, за счет неспецифических механизмов.

Основным источником иерсиниозов являются дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Возможно зара­жение человека от человека. Штаммы Y.pseudo-tuberculosis выделены от 175 видов млекопитающих, 124 видов птиц, 7 видов рыб. Зараженные грызуны, животные и люди выделяют возбудителя с испражнениями и мо­чой, загрязняя воду, растения и другие объекты внешней среды. Таким образом, пищевой путь в передаче возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза является ведущим. Заражение происходит в ре­зультате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обра­ботанных продуктов (мяса, мясных продуктов, молока, овощей, фруктов, зелени). Оба вида возбудителя способны существовать внутри растений (салата, гороха, овса и т.п.).

Заболевания, вызываемые иерсиниями, характеризуются полиморфностью клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации, септикопиемии и поражению различных ор­ганов и систем.

Патогенные свойства иерсиний обоих видов, как и возбудителя чу­мы, во многом определяются наличием у них плазмид с молекулярной массой 42-48 МД и 82 МД. Плазмиды контролируют такие свойства возбу­дителей, как зависимость роста от наличия в среде кальция, способ­ность синтезировать антигены вирулентности (v-w), пили адгезии, спо­собность вызывать керато-конъюнктивит у морской свинки и т.п.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает использо­вание бактериологического метода и серологических реакций.

При бактериологическом методе исследуемый материал от больных (испражнения, кровь, слизь из зева), а также подозрительные продук­ты или воду засевают на среды Эндо, Плоскирева, Серова (индикатор­ную и дифференциальную) и инкубируют при 37° в течение 48-72 часов.

Подозрительные колонии (мелкие бесцветные на средах Эндо и Плоскирева и окрашенные колонии двух различных форм на средах Серова) пересевают для получения чистых культур, которые идентифицируют по биохимическим признакам и окончательно типируют с помощью диагности­ческих агглютинирующих сывороток.

Для серологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза используют развернутую реакцию агглютинации (по типу реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами или реакцию пас­сивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считают реакции при титре антител 1:400 и вы­ше. Реакции рекомендуется ставить с парными сыворотками (с интерва­лом в несколько дней). Нарастание титра антител будет свидетельство­вать о специфичности инфекционного процесса.

Б. Классификация вида Yersinia pestis (Саратов, 1985)

Y. pestis subsp. pestis - основной подвид

Y. pestis subsp. altaica - алтайский подвид

Y. pestis subsp. caucasica - кавказский подвид

Y. pestis subsp. hissarica - гиссарский подвид

Y. pestis subsp. ulegeica - улэгейский подвид

В. Особенности генетического контроля факторов

патогенности у возбудителя чумы.

Контроль наиболее важных факторов патогенности возбудителя чу­мы осуществляется плазмидами, на которых локализованы гены вирулентности. Известны три класса плазмид, контролирующих различные факто­ры патогенности возбудителя: рУР (м.м.6 МД); рУТ (м.м. 60 МД) и рУV (м.м. 47 МД).

Плазмида рУР (6 МД) несет гены, определяющие синтез пестицина. фибринолизина и плазмокоагулазы.

Плазмида рУТ (60 МД) несет детерминанты, контролирующие синтез антигена фракции I и "мышиного" токсина.

Плазмида рУV (47 МД) ответственна за синтез антигенов v и w и термоиндуцибельных белков внешней мембраны, а также зависимость роста чумной палочки от наличия в среде ионов Са++.

Г. Основные различия между возбудителями чумы,

псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза.

Признак	Вид возбудителя
Возбудитель чумы	Возбудитель псевдотуберкулеза	Возбудитель кишечного иерсиниоза
Подвижность	-	+	+
Лизис а) индикаторным чумным фагом	+	-	-
б) псевдотуберкулезным фагом	-	+	-
Рост на голодно-кислой среде	-	+	+
Ферментация: рамнозы	-	+	-
маннита	+	+	+
мальтозы	+	+	+
сахарозы	-	-	+
Наличие: уреазы	-	+	+
аденозиндезаминазы	-	+
плазмокоагулазы	+	-	-
фибринолизина	+	-	-
Фракции 1	+	-	-
Вирулентность: в S-форме	-	+	+
в R-форме	+	-	-

Д. Основные дифференциальные признаки

Bacillus anthracis и Bacillus anthraсоides

Вид микроорганизма	Подвижность	Капсуло- образование	Гемолиз	Патогенность для морских свинок и кроликов
Bacillus anthracis	-	+	-	+
Bacillus anthraсоides	-(- +)	-	+	-

Е. Факторы патогенности и генетический

контроль их синтеза у возбудителя

сибирской язвы

Основными факторами патогенности сибиреязвенной палочки, которые
определяют патогенез заболевания,являются сложнокомпонентный токсин
и капсула. .

Синтез сложного токсина контролируется плазмидой pXOI, имеющей молекулярную массу 110-114 МД. В составе плазмиды pXOI имеется три гена, определяющих синтез основных компонентов экзотоксина:

ген cya-ОФ, определяет синтез фактора отечности

ген pag-ПА, определяет синтез протективного антигена

ген lef-ЛФ, определяет синтез летального фактора

Продуктом гена суа-ОФ является аденилатциклаза, катализирующая накопление в клетках эукариотов цАМФ.

Синтез капсулы сибиреязвенной палочкой контролируется плазмидой рХO2, имеющей м.м. 60 МД.

Ж. Географические разновидности туляремийных бактерий.

Расы	Ферментация глицерина	Наличие цитруллин-уреидазы	Патогенность для домашних кроликов и людей
Голарктическая раса (Европа, Азия) Francisella tularensis holarctica	-	-	умеренно патогенна
а) японский вариант - var. japonica	+	-	“
Среднеазиатская раса - Francisella tularensis mediasica	+	+	“
Неарктическая, или американская, раса - Francisella tularensis nearctica	+	+	Относительно высокая патогенность для кроликов и людей

З. Ландшафтные типы природных очагов туляремии.

Пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорно-ручьевой, тугайный (пойменно-пустынный) и тундровый.

ЗАНЯТИЕ 5.

Дата_________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(брюшной тиф и паратифы)

План занятия

1. Изучение морфологических и биохимических свойств бактерий
тифо-паратифозной группы.

2. Бактериологическое исследование крови брюшнотифозного больного. Посев крови на среду с желчью (разбор с демонстрацией).

3. Реакция Видаля. Постановка реакции агглютинации с 0- и Н-диагностикумами.

4. Бактериологическое исследование испражнений брюшнотифозного больного: посев на среду обогащения и дифференциально-диагностические среды.

5. Разбор методов диагностики брюшнотифозного бактерионосительства.

Методические указания.

§ 1. Приготовить препараты-мазки из культур бактерий - возбудителей брюшного тифа, паратифа А, паратифа В и кишечной палочки, окрасить по Граму и промикроскопировать. Сравнить морфологию бактерий во всех препаратах и отметить морфологическое сходство их друг с другом.

Препараты зарисовать.

.Изучить и записать в тетрадь биохимические свойства бактерий тифо-паратифозной группы по готовым демонстрационным наборам посевов на среды "пестрого ряда".

§ 2. Взятая из вены больного кровь в количестве 8-10 мл для выделения гемокультуры засевается в среду с желчью (МПБ + 10 процентов желчи + 1 процент глюкозы + индикатор Андреде).

Посев крови производят непосредственно у постели больного в десятикратный (по отношению к количеству крови) объем питательной среды. Посев помещают в термостат при 37°, а на следующие сутки производят высев на скошенный агар и на дифференциально-диагностические среды (Левина, Плоскирева, висмут-сульфит-агар, Эндо).

§ 3. Реакцию Видаля ставят с 0-Н-диагностикумами для обнаружения О- и Н-антител в крови больного брюшным тифом. Для этого необходимо взять два ряда пробирок по 6 шт. и в каждом из них приготовить последовательно разведения сыворотки больного в физиологическом растворе по следующей схеме:

Номера пробирок
Разведения сыворотки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	контроль антигена
Физиологический раствор		0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Сыворотка больного в разведении 1:25	0,5	0,5
Диагностикум O (H)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

Во второй пробирке сыворотку смешать с физиологическим раствором и 0,5 мл перенести в третью, снова перемешать и 0,5 мл смеси перенести из третьей пробирки в четвертую, а из четвертой - таким же способом в пятую. После перемешивания из пятой пробирки 0,5 мл смеси удалить в банку с раствором хлорамина.

В пробирки первого ряда добивать по 0,5 мл брюшнотифозного 0-диагностикума, а в пробирки второго ряда - по 0,5 мл брюшнотифозного Н-диагностикума. Предварительные результаты реакции учесть после 2-часового инкубирования пробирок в термостате при 37º, а окончательные - на следующем занятии, после суточного выдерживания при комнатной температуре.

§ 4. Испражнения брюшнотифозного больного засеять на одну из сред обогащения (среда магниевая, среда с селенитом) и одновременно на дифференциально-диагностические среды: Эндо, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар. Через 8-10 часов инкубирования в термостате со среды обогащения также производится посев на плотную дифференциально-диагностическую среду.

Рисунок 1. Возбудитель брюшного тифа. Salmonella typhi.

Рисунок 2. Возбудитель паратифа А. S. paratyphi А.

Рисунок 3. Возбудитель паратифа В. S. paratyphi B.

Рисунок 4. Кишечная палочка. Eschrichia coli.

Бихимческие свойства бактерий тифо-паратифозной

группы.

Вид микроба	Лак- тоза	Глю- коза	Ман-нит	Саха-роза	Моло-ко	Индол	Серо-водород	Подвиж-ность
S. typhi
S. paratyphi А
S. paratyphi B
Eschrichia coli