Б. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

§ I. Вирусологический диагноз полиомиелита . Материалом для диагностики полиомиелита слу­жат испражнения больного, готовят 10%-ную взвесь испражнений в растворе Хэнкса, центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают ан­тибиотиками (1000 ед, пенициллина и 1000 ед. стрептомицина на I мл). Подготовленный таким образом материал смешивают со свежей питатель­ной средой. Выросшую однослойную культуру ткани просматривают под микроскопом и отбирают пригодную для заражения. Стерильной пастеров­ской пипеткой отсасывают питательную среду. В культуру ткани вносят I мл материала в свежей питательной среде и пробирку ставят в гори­зонтальном штативе в термостат.

§ 2. Серологический диагноз полиомиелита . Определение антител и их, титра к вирусу полиомиели­та производят с помощью метода цветной пробы. Сыворотку больного полиомиелитом разводят в пробирках от 1:4 до 1:64 в объеме 0,25 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл вируса полиомиелита и по 0,4 мл вазелинового масла. Через 40-60 минут в пробирки вносят по 0,25 мл клеточной суспензии, содержащей 100000 живых клеток в 1 мл. После инкубирования пробирок в термостате в течение 3-7 дней учитывают результат. Пожелтение среда в пробирках указывает на нейтрализацию вируса антителами и рост культуры клеток. Наибольшее разведение сы­воротки, нейтрализующее вирус, является титром сыворотки.

Обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации

Реакция преципитации в агаре широко используется для диагнос­тики вирусных заболеваний (полиомиелита, коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах.

Постановка реакции преципитации на предметных стеклах. На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлаждённого до 60⁰ агара (1%-ный агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4 мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могут быть различными в зависимости от условий опыта. Объем исполь­зуемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и в каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый антиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципи­тации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном.

Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере.

Рис.1 Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления вирусного антигена. Обозначения: Сс - сыворотка специфическая Сн - сыворотка нормальная Ас - антиген сцецифический Аи - антиген искомый

Рис.2 Схема постановки и результаты опыта по определению типа и титра противогриппозных антител в сыворотке больного.

Рис.3 Схема определения титра антител методом цветной пробы.

Сыворотка в мл.	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	—	—
Вирус в мл.	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	—	—	0,25
Клетки в мл.	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25

Заключение:______________________________

Вирусологический (диагностика ОРЗ)

Рис.4 Смыв из носоглотки, обработанный антибиотиками

Заражение куриных эмбрионов в аллантоисную или амниотическую полости. Вирус обнаруживают путем реакции гемаг-глютинации, типируют с помощью РТГА

Заражение культуры ткани.   В культуре ткани вирус обнаруживают по цитопатическому эффекту, по изменению цвета среды и по реакции гамадсорбции; типируют по РТГА, нейтрализации ЦПЭ и реакции гемадсорбции.

Заражение белых мышей.   Типируют вирус мотодом нейтрализации со специфическими сыворотками.

I. Методы микробиологической диагностики острых респираторных заболеваний

А. Вирусоскопический

Материал со слизистой носа, зева эмульгируют в физиологическом растворе, осаждают и из осадка готовят мазки.

Мазки после высушивания обрабатывают типоспецифическими люминесцирущими сыворотками и микроскопируют с помощью люминесцентно­го микроскопа. Клетки, содержащие соответствующий вирус, адсорби­руют специфические люминесцирующие антитела и светятся.

Б. Вирусологический (см. схему).

В. Серологический

Определяют нарастание титра специфических антител в исследуе­мых парных сыворотках с помощью РТГА, РСК и РН (см. схему).

П. Методы микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций

А. Вирусологический

Поскольку вирусы Коксаки и ЕСНО могут вызывать полиомиелитоподобные заболевания, исследование ведется с целью возможного выде­ления любого из трех видов вируса, для чего вирус выделяется пара­ллельно на культурах ткани и заражением однодневных мышей. (Схему см. ниже Рис.5). Материал: испражнения, иногда спинномозговая жидкость, слизь из зева, кровь.

Цитопатический эффект и образование бляшек (вирусы Коксаки часто не вызывают цитопатического эффекта).

Титрование выделенных вирусов с помощью реакции нейтрализации на культуре ткани с сыворотками против вирусов полиомиелита, вирусов Коксаки А и В, вирусов EСНО. При совпадении типов вируса и сыворот­ки отмечается рост культуры, изменение цвета среды и отсутствие бля­шек.

Параличи и смерть наступают в присутствии вирусов Коксаки А и В.

Вирусы Коксаки А через 3-5 дней вызывают вялые параличи мышц с ценкеровским некрозом.

Вирусы Коксаки В через 6-8 дней вызывают некроз бурого жира в межлопаточной области и спастические параличи в результате поражения центральной нервной системы.

Б. Серологический

Обнаружение нарастания антител в крови больных к выделенным вирусам ECHO производят с помощью РТГА, к вирусам Коксаки - по реак­ции нейтрализации и цветной пробе, к вирусам полиомиелита - по реак­циям нейтрализации, преципитации и РСК.