Аппаратурное оформление метода ГЖХ

Прибор для определения спиртов и других «летучих» ядов состоит из следующих блоков:

2- устройство ввода пробы

3- хроматографическая колонка (разделение веществ)

4- детектор (регистрация сигналов веществ)

5- самописец (хроматограмма)

1. В качестве газа-носителя используется инертный газ (азот, гелий, аргон), находящийся в баллоне под большим давлением, выполняющий роль подвижной фазы. К нему предъявляются следующие требования:

- газ-носитель должен быть инертен к материалу колонки, твердому носителю и неподвижной жидкой фазе, к исследуемым веществам,

- газ должен обладать малой сорбируемостью на неподвижной жидкой фазе,

- газ должен обеспечивать хорошее разделение веществ,

- газ должен соответствовать чувствительности и принципу работы детектора,

- газ должен обладать высокой теплопроводностью, быть достаточно чистым и доступным.

В химико-токсикологическом анализе в качестве газа – носителя чаще всего используются азот и гелий.

2. Хроматографические колонки представляют из себя V-образные или спиралевидные трубки из инертных материалов (металлические, стеклянные, полимерные) с внутренним диаметром 2-6 мм, длиной 2-6 метров. Основное требование к материалу колонки – инертность по отношению к газу-носителю, твердому носителю и неподвижной жидкой фазе, к исследуемым веществам.

Набивка колонки состоит из твердого носителя (т.н.) и неподвижной жидкой фазы (н.ж.ф.), которая в виде тонкой пленки наносится на гранулы т.н.

Большинство твердых носителей готовят из диатомитовой (диатомовой) земли, представляющей из себя разновидность окислов кремния, а также из огнеупорного кирпича (инзенский кирпич), который по свойствам близок к диатомитовой земле. В настоящее время существует большое количество синтетических т.н. различных марок. Чаще всего используется хроматон, хромосорб, полисорб, целит и др.

Основные требования к твердому носителю:

- должен обеспечивать равномерное распределение на его поверхности н.ж.ф. (должен ею смачиваться),

- должен иметь большую удельную поверхность (на 1г т.н. должна приходиться площадь от 1 до 20 кв.метров),

- должен быть инертным к материалу колонки, н.ж.ф., анализируемым веществам,

- должен быть термостабильным при температуре опыта,

- должен быть механически прочным, гранулы не должны ломаться при пересыпании.

В качестве неподвижной жидкой фазы обычно используют жидкие высокомолекулярные вещества (ВМС), имеющие высокую температуру кипения. Н.ж.ф. наносят тонким слоем на гранулы т.н. в количестве от 5 до 30% от его веса, чтобы не было слипания частиц т.н. К ВМС такого типа относятся полиэтиленгликоли ( полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1000-1500, триэтиленгликоль), эфиры полиэтиленгликолей, смеси углеводородов, различные высококипящие масла и ряд других веществ (около 400 наименований). Характеристики различных н.ж.ф. приводятся в справочной литературе.

Требования к н.ж.ф.:

- низкая летучесть (высокая температура кипения),

- термостабильность,

- химическая инертность к материалу колонки, т.н., к веществам,

- должна обеспечивать четкое разделение хроматографируемых веществ, т.е. вещества должны иметь в этой н.ж.ф. различные коэффициенты распределения и различные времена удерживания.

3. Детектор представляет из себя устройство, которое регистрирует выходящие из колонки вещества и измеряет их количество. Главное требование, предъявляемое к детектору, - высокая чувствительность к определяемым веществам. Чаще всего в химико-токсикологическом анализе используют детектор по теплопроводности (ДТП), или катарометр, и пламенно-ионизационный детектор (ПИД).

Катарометр.Схема устройства.

На схеме:

1- сравнительная камера

2- измерительная камера

R1 и R2 - нити сопротивления

Принцип действия катарометра состоит в измерении разности теплопроводностей чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси газа с анализируемым веществом, выходящей из колонки в измерительную камеру. Чем больше эта разница, тем выше чувствительность детектора. Самой большой теплопроводностью обладает гелий, поэтому при работе с ним достигается наиболее высокая чувствительность детектора. При использовании в качестве газа-носителя азота чувствительность снижается.

Нити сопротивления R₁ и R₂ в сравнительной и измерительной камерах детектора одинаковы. Если в обе камеры поступает чистый газ-носитель, одинаково охлаждающий сопротивления R₁ и R₂, тока в цепи детектора не возникает, так как эти сопротивления являются плечами моста Уитстона.

На схеме моста Уитстона

R₃ и R₄ – уравновешивающие сопротивления,

G- гальванометр.

В этом случае самописец вычерчивает прямую линию (сигнал от газа-носителя, нулевая линия на хроматограмме). Когда в газовом потоке появляется вещество (в измерительной камере), меняется теплопроводность газа, что приводит к изменению сопротивления R₂, разбалансировке моста и возникновению тока в цепи детектора. Сигнал с детектора поступает на самописец, который вычерчивает хроматографический пик. Величина пика (т.е. высота и площадь) пропорциональна сигналу детектора и количеству вещества в пробе, на чем и основано количественное определение.

Катарометр является универсальным детектором, он реагирует на все вещества (органические и неорганические), теплопроводность которых отличается от теплопроводности газа-носителя.

Чувствительность определения составляет 10^-3 - 10^-5 г.

Ионизационно-пламенный детектор (ПИД). Схема устройства.

В настоящее время ПИД является наиболее распространенным в газовой хроматографии. Принцип работы ПИД основан на том, что выходящий из колонки газ смешивается с водородом и сжигается в атмосфере воздуха или кислорода. Образующиеся в присутствии исследуемого вещества ионы и электроны ионизируют пламя, в результате чего возникает ионный ток между электродами детектора, находящимися под напряжением. Сигнал детектора (ионный ток) поступает на самописец, вычерчивающий хроматограмму.

Чувствительность ПИД на несколько порядков выше чувствительности катарометра и составляет 10^-9-10^-12 г/сек. (количество органического вещества, поступающего в камеру ПИД в единицу времени).

ПИД чувствителен ко всем органическим соединениям и проявляет к ним селективность. Мало чувствителен по отношению к воде, окиси и двуокиси углерода, аммиаку, окислам азота и ряду других веществ. Низкая чувствительность ПИД к воде делает его особенно удобным при анализе биологических жидкостей.

Определение этанола методом ГЖХ

Определение этилового спирта в биологических жидкостях (крови и моче) методом ГЖХ при судебно-химических исследованиях было предложено в 1968 году судебным химиком Таджикского республиканского БСМЭ В.Ф.Пономаревым.

Метод основан на превращении спиртов в сложные эфиры азотистой кислоты – алкилнитриты, высоколетучие соединения, которые подвергаются газохроматографическому анализу. В основе метода лежат реакции:

R-OH → R-ONO

CCl₃COOH + NaNO₂ → CCl₃COONa + HNO₂

HNO₂ + C₂H₅OH → C₂H₅ONO↑ + H ₂O

избыток 2HNO₂ → H ₂O +NO+NO₂

Эти реакции выполняются в герметично укупоренном флаконе. Парогазовую фазу, содержащую алкилнитриты, в количестве 0,5 – 3мл отбирают шприцем, прокалывая пробку флакона, и вводят в колонку хроматографа.

При определении спиртов технические параметры следующие

- газ-носитель – азот,

- твердый носитель –инзенский кирпич или хроматон,

- неподвижная жидкая фаза –винилин или триэтиленгликоль в количестве 5% от веса твердого носителя,

- колонка металлическая диаметром 3-6мм, длиной 2 м,

- детектор – катарометр.

Спирты выходят из колонки в порядке молекулярной массы в гомологическом ряду, причем изомеры выходят раньше нормальных спиртов.

Хроматограмма смеси спиртов С₁ – С₅ в виде их алкилнитритов выглядит следующим образом:

1-окислы азота NO и NO₂

2-метилнитрит CH₃ONO

3-этилнитрит C ₂H ₅ONO

4-изопропилнитрит i-C ₃H ₇ONO

5-пропилнитрит н- C ₃H ₇ONO

6-изобутилнитрит i-C ₄H ₉ONO

7-бутилнитрит н-C ₄H ₉ONO

8-изоамилнитрит i-C ₅H ₁₁ONO

9-амилнитрит н-C ₅H ₁₁ONO

Идентификацию спиртов проводят по относительному времени удерживания их алкилнитритов, используя в качестве метчика (стандарта) метанол.

Разделение веществ на колонке дает возможность определять индивидуально каждый спирт и другие «летучие» яды, т.е. делает метод специфичным.

Количественное определение этанола проводят по высоте или площади хроматографического пика, используя метод внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют нормальный или изо-пропанол, который добавляют в известном количестве во флакон с пробой.

Расчет проводят по калибровочному графику, который строится заранее по растворам этанола с известной концентрацией (1, 3 или 5‰), или по методу котангенса. Калибровка строится по водным растворам этанола, поэтому при работе с биожидкостями вводят поправочные коэффициенты: 0,95 для крови и 1,05 для мочи.

Оценка результатов количественного определения