Тема: ИММУНИТЕТ. РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ

План занятия

1.Регистрация результатов опыта по определению титра агглютинирующей сыворотки.

2.Использование классического пробирочного метода реакции
агглютинации для:

а) определения титра антител в сыворотке больного (серологический метод диагностики);

б) определения антигенного строения выделенного возбудителя (серологическая идентификация возбудителя в ходе бактериологического исследования).

3.Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), или непрямой гемагглютинаций (НПГА). Варианты использования РПГА.

4.Варианты реакций агглютинации на стекле, которые используют
в качестве методов экспресс-диагностики:

а) реакция коагглютинации;

б) реакция летекс-агглютинации;

в) реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) и др.

5.Реакция преципитации. Получение бактериального гаптена и
постановка реакции кольцепреципитации.

6. Реакция преципитации в геле (агаре) для определения:

а)природы антигена;

б)природы антител.

7.Применение методов иммуносорбентного анализа твердой фазы:

а)применение иммуноферментного метода (ИФМ);

б)применение радиоиммунного метода (РИМ).

8.моноклональные антитела и их применение.

Методические указания

§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.

Результаты реакции агглютинации учитываются следующим образом:

++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, хорошо выраженный осадок;

+++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выраженный;

++ жидкость непрозрачная, выраженный осадок;

+ сомнительная реакция;

— отрицательная реакция, взвесь равномерно мутная, осадок отсутствует.

Титром агглютинирующей сыворотки следует считать максимальное разведение ее, при котором еще произошла реакция агглютинации в степени не менее, чем в два плюса.

§ 2. Развернутая (пробирочная) реакция агглютинации ставится или с сывороткой больного (для определения в ней титра антител) или с диагностической сывороткой (для изучения антигенной структуры выделенного возбудителя). В том и другом случае дяя постановки опыта

необходимы:

а)сыворотка больного в разведении 1:25 или диагностическая сы­
воротка в исходном разведении (или в сухом виде, тогда она разводится в отношении 1:25 или 1:50);

б)диагностикум - взвесь соответствующих известных убитых бак­терий в I мл I млрд микробных тел (для серологической диагностики) или взвесь исследуемых бактерий (для определения их антигенной структуры);в) физиологический раствор;

г)пипетки объемом I мл и 5 мл;

д)штатив с набором агглютинационных пробирок.

Техника развернутой реакции агглютинации изложена в занятии 10.

§ 3. В настоящее время для диагностики многих заболеваний широко используется реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Она основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности специфические микробные антигены или антитела к ним. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствии гомологичных антител или антигенов. Для постановки реакции пассивной гемагглютинации необходимо иметь:

1. Сенсибилизированные эритроциты, или эритроцитарный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антигены возбудителя) или эритроцитарный антительный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антитела к микробным антигенам). Метод сенсибилизации эритроцитов зависит от вида возбудителя или природы антител.

2.Исследуемую сыворотку (сыворотку больного или бактерионоси­теля, в которой определяют наличие антител к возбудителю) или дру­гой материал от больного, в котором предполагается наличие возбудителя или его антигенов.

3.Физиологический раствор.

4.Соответствующие контрольные системы (заведомо положительные и заведомо отрицательные) для большей, специфичности диагноза.

Для постановки РПГА используют либо круглодонные агглютинационные пробирки одинакового диаметра либо специальные полистироло­вые пластинки с луночками.

Постановка опыта

Во все пробирки (луночки) разливают физиологический раст­вор: в 1-ю пробирку -0,9 мл, а в остальные - по 0,5 мл. Затем в 1-ю пробирку вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки, перемешивают и пе­реносят 0,5 мл во 2-ю, вновь перемешивают и переносят из 2-й пробирки в 3-ю 0,5 мл и так далее до 7-й пробирки включительно. Из 7-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают, 8-я пробирка служит контро­лем и поэтому сыворотки не содержит.

Эритроцитарный диагностикум перед использованием встряхивают до полного исчезновения осадка на дне и получения гомогенной взвеси. По ходу работы встряхивание часто повторяют. Эритроцитарный диагностикум разливают во все пробирки по 0,5 мл. после этого пробирки встряхивают и помещают на 1,5-2 часа в термостат при 37° , а затем учитывают результаты реакции (иногда через 16-20 часов).

Учет реакции производят по четырехкрестной схеме:

++++ полная гемагглютинация, эритроциты равномерно устилают почти все дно пробирки, нередко в виде зонтика;

+++ почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покры­вают дно пробирки;

++ наряду с равномерным агглютинатом на дне пробирки имеется осадок в виде маленького колечка или "пуговки";

+ большинство эритроцитов осело в центре дна пробирки в виде диска и лишь незначительное количество агглютинировалось с образованием мелких хлопьев;

—признаков агглютинации нет: эритроциты осели в виде маленького колечка или "пуговки" (диска) в центре дна пробирки.

Титром испытуемой сыворотки считается последное ее разведение, которое дает ярко выраженную агглютинацию эритроцитов, не менее чем на +++. Вариантами использования РПГА являются реакция нейтрализации антигена (рНАг), реакция нейтрализации антител (рНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используются антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаймоконтролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и рНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (рНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммуннойсывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при 37⁰ в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 часа и окончательно через 18-24 часа. Если в исследуемом материале имеется антиген, то он свяжет антитела (нейтрализует их) и поэтому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставится реакция нейтрализации антигена (рНАг). Только в этом случае в исследуемом материале содержатся искомые антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т.е. произойдет нейтрализация антигена антителами и гемагглютинации при добавлении атителъного эритроцитарного диагностикума не произойдет.

§ 4. Одним из вариантов пассивной, т.е. опосредованной клетками-носителями антител, реакции агглютинации является коагглютинация. В основу этой реакции положено уникальное свойство стафилококков, имеющих в составе своей клеточной стенки белок А, связывать молекулы иммуноглобулинов классов Ig G и Ig M. Поскольку белок А взаимодействует с рецептором, который располагается на Fc - фрагменте молекулы антитела, его активные центры остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигена.

Методика реакции.

На предметное стекло наносится капля 2% взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий, тщательно перемешивают. Результаты учитывают в течение 30-60 сек. и оценивают по 3-х крестной системе. При соответствии антигена антителам происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков. Для контроля каплю взвеси стафилококков добавляют в каплю физиологического раствора. В контрола агглютинации не должно быть.

б)Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ) также является чувствительным и специфическим методом диагностики. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы при постановке реакции, выполняемой микрометодом, в лунках на стекле: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, частички которого несут на себе специфические антитела. После перемешивания смесь в течение 10 мин встряхивают. Результаты учитывают по 4-х крестной системе. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем двумя крестами. Всего на постановку реакции и ее учет тратится-около 30-40 мин. Специфичность ЛАГ оценивается с помощью трех контрольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах (заведомо положительная реакция, заведомо отрицательная, контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ несенсибилизированных, т.е. не несущих антител, латексов с исследуемым материалом. Все ингредиенты ЛАГ, включая контроля, входят в состав тест-системы. В качестве носителей специфических антител в нашей стране используются: полистироловые монодисперсные латексн с разными диаметрами частиц (0,3; 0,8; 0,66; 0,75 мкм).

в)Реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) позволяет быстро обнаружить в крови больного как свободно циркулирующие антигены (антигенемия), так и антигены, связанные с антителами (циркулирующие иммунные комплексы - ЦИК). Для РАГА используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующими антителами. Добавление сыворотки больного, в которой содержатся антигены, к сенсибилизированным эритроцитам, на которых фиксированы антитела, приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов и антигенных комплексов.

§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

а)преципитирующую сыворотку;

б)антиген в виде прозрачного раствора (экстракт из микробных
тел, из органов или из других патологических субстратов);

в)физиологический раствор;

г)набор специальных преципитационных пробирок.

Порядок работы

В преципитационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, затем при помощи пастеровской пипетки наслаивают на сыворотку 0,5 мл раствора антигена. Пробирку при этом следует держать в наклонном положении, а после добавления антигена пробирку ставят в штатив (в вертикальном положении). При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется тонкое кольцо помутнения. Степень реакции оценивается по выраженности кольца и времени его появления. Обычно кольцо появляется в течение первых 3-10 минут.