Задания к лабораторной работе

1 Для ознакомления с морфологией бактерий (со спирохетами) следует приготовить фиксированный окрашеный препарат зубного налета. Особенно удачны препараты соскоба из кариесного (гнилого) зуба. Зубные спирохеты чрезвычайно тонкие, почти волосовидные, короткие (всего 2—3 завитка).

2 Приготовить из чистых культур микроорганизмов фиксированные препараты, окрасить их простым способом, изучить форму, размеры и взаимное расположение микроорганизмов.

3 Для ознакомления с методикой сложного окрашивания и типом клеточной стенки бактерий, приготовить из чистых культур микроорганизмов фиксированные препараты, окрасить их дифференциальным способом по Граму.Произвести световую микроскопию препаратов. Результаты микроскопирования зарисовать, описать форму микроорганизмов.

4 Определите тип клеточной стенки бактерий методом «тяжа». Учтите результат реакции, сделайте заключение о типе клеточной стенки исследуемой культуры.

Вопросы к защите лабораторной работы

1 Общая характеристика бактерий.

2 Морфология бактерий.

3 Строение бактериальной клетки.

4 Способы размножения бактерий.

5 Спорообразование.

6Этапы приготовления окрашенных препаратов.

7 Простое окрашивание микроорганизмов. Цель, методика.

8 Окраска бактерий по методу Грамма.

Лабораторная работа № 4. Эндоспоры, цитоплазматические включения бактерий. Передвижение бактерий

Цель работы - выявить наличие капсулы и эндоспор у исследуемых бактерий, изучить цитоплазматические включения и подвижность бактерий.

Капсула бактерий

При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии капсулообразующих бактерий имеют влажную, блестящую поверхность и называются мукоидными. Среди сапрофитных бактерий капсула хорошо выражена у представителей родов Azotobacter, Leuconostoc, Rhizobium, патогенных – Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae и др.

Капсула предохраняет клетку от обезвоживания, механического повреждения, капсульное вещество создает вокруг клетки дополнительный осмотический барьер, регулирующий поступление и выделение различных веществ и ионов, а также аэрацию бактерий. Лучше всего капсулы выявляются во влажных препаратах, так как составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации.

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить:

Окраска по Бури.Методика окрашивания:

На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают её петлёй с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы.

Можно применить так же усовершенствованный метод Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования).

Методика окрашивания.

1 На предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий.

2 Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок как мазок крови (ребром одного стекла проводят по поверхности другого).

3 Мазок высушивают на воздухе.

4 Микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

Эндоспоры бактерий

Важной особенностью многих микроорганизмов, значимой для их длительного переживания при неблагоприятном изменении условий существования, является способность к образованию морфологически дифференцированных клеток, объединяемых общим понятием «покоящиеся формы». В некоторых случаях для их образование необходимо особое неравное деление исходной родительской клетки, в других случаях в покоящееся состояние переходит обычная вегетативная клетка.

Общей морфологической особенностью покоящихся форм является упрочение поверхностных барьерных структур, имеющихся и у обычных вегетативных клеток микроорганизмов, а также, в ряде случаев, возникновение дополнительных поверхностных образований.

Общей физиологической особенностью покоящихся форм является выраженное угнетение процессов обмене веществ и энергии, что сопровождается общим снижением активности метаболического, биосинтетического и генетического аппаратов бактериальной клетки. В то же время для некоторых из покоящихся форм характерно накопление ряда резервных питательных веществ (в виде включений).

Важным следствием морфофункциональных перестроек в покоящихся формах микроорганизмов является приобретение ими повышенной устойчивости к действию разнообразных повреждающих факторов среды обитания: высоких и низких температур, кислотности среды, радиации и др.

Спорообразование свойственно бактериям нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, которая может размещаться центрально (у бацилл); субтерминально или терминально, превышая диаметр материнской клетки (у клостридий). Это приводит к формированию у клостридий клеток веретеновидной формы (Clostridium perfringens), разливной ложки (Clostridium diauvoci), ракетки или барабанной палочки (Clostridium tetani). Бактериальные споры устойчивы к высокой температуре, высушиванию, воздействию токсических веществ и других неблагоприятных факторов.

Микроскопическое выявление эндоспор основано на их особенностях, возникающих при спорообразования и значимо отличающих подобные структуры от исходной родительской клетки (спорангия), внутри которой они образуются. При этом в качестве подобной особенности наиболее часто используется кислотоустойчивостьэндоспор, определяющая различное сохранение красителя в эндоспоре и спорангии после обработке сильными обесцвечивающими реагентами.

Бактериальные споры могут быть выявлены с использованием как простых, так и сложных методов окраски. Например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина микроорганизм окрашивается в зеленый цвет, споры – бесцветные, а фон – черный.

Наиболее простой метод подобен окраске кислотоустойчивых бактерий.

Методика окрашивания.

1 Препарат, подготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1-2 мин карболовым фуксином Циля.

2 Промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2 % раствор азотной кислоты в спирте или 1 % водный раствор серной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя.

3 Промывают водой.

4 Докрашивают водным раствором метиленового синего.

В результате окрашивания споры окрашиваются в красный цвет.

Наиболее часто используемым сложным методом окрашивания эндоспор является метод Шефера – Фултона.

Методика окрашивания.

1 Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 5-6 капель 0,5 % водного раствора малахитового зеленого и 2 – 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров.

2 Фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают водой и в течение 30 с докрашивают 0,5 % раствором сафранина.

3 Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка – в красный.