Методика определения аминного азота в сыворотке крови нингидриновым методом

Практическое занятие №10.

Задание к занятию №10.

Тема: Обмен и функции аминокислот.

Актуальность темы.

Значение аминокислот для организма определяется тем, что они используются для синтеза белков, метаболизм которых занимает особое место в процессах обмена веществ между организмом и внешней средой. Белки входят во все структурные компоненты клеток, тканей и органов, выполняют ферментативные функции, участвуют в переносе веществ через мембраны и т. д. Важную роль в координации работы всех систем клеток играют белковые гормоны. Аминокислоты участвуют в биосинтезе большого количества других биологически активных соединений, регулирующих процессы обмена веществ в организме - нейромедиаторы, гормоны. Аминокислоты служат донорами азота при синтезе всех азотсодержащих небелковых соединений: нуклеотидов, гема, креатина, холина и других веществ. Энергетическая функция аминокислот становится значимой при голодании, некоторых патологических состояниях – сахарный диабет и других. Изучение особенностей обмена некоторых аминокислот в организме имеет большое значение в постановке диагноза заболеваний, т.к. они принимают участие в различных обменных процессах в организме.

Учебные и воспитательные цели:

- Общая цель занятия:

научить использовать знания о путях использования аминокислот в организме в практической

медицине.

- Частные цели

уметь определять свободный аминный азот в сыворотке крови нингидриновым методом.

1. Входной контроль знаний:

1.1. Тесты.

1.2. Устный опрос.

2. Основные вопросы темы:

2.1. Биологическая ценность белков. Незаменимые аминокислоты.

2.2. Нормы белка в питании у детей. Азотистый баланс, его виды, значение.

2.3. Переваривание белков и всасывание аминокислот в желудочно-кишечном тракте. Нарушение

переваривания белков и всасывания аминокислот.

2.4. Гниение белков в кишечнике. Пути использования аминокислот в организме после всасывания.

2.5. Декарбоксилирование и трансаминирование, биологическое значение. Диагностическое значение

определения активности трансаминаз.

2.6. Дезаминирование окислительное и непрямое аминокислот.

3. Лабораторно-практические работы:

3.1. Определение свободного аминного азота в сыворотке крови нингидриновым методом, значение для

клинической практики.

Выходной контроль

4.1. Ситуационные задачи.

5. Литература:

5.1. Материал лекций.

5.2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина», 1990г., с. 318-359, 356-358.

5.3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина», 2004г., с. 409-446.

2. Основные вопросы темы

2.1. Биологическая ценность белков. Незаменимые аминокислоты.

Белки – высокомолекулярные азотсодержащие соединения, состоящие из аминокислот, связанных пептидными связями, - являются носителями жизни. Роль белков: транспортная, защитная, каталитическая, структурная, сократительная, регуляторная, рецепторная, энергетическая.

Состояние белкового обмена организма зависит не только от количества принимаемого белка, но и от его качественного состава. Те белки, которые по аминокислотному составу близки к аминокислотному составу организма, лучше подвергаются гидролизу в ЖКТ, т.е. степень их усвоения большая. Эти белки являются биологически более ценными. Они содержат более полный ассортимент незаменимых аминокислот. Под биологической ценностью индивидуального белка понимают его относительно питательную ценность по сравнению со стандартным белковым препаратом с учетом фактора перевариваемости и аминокислотного состава. Стандартным белковым препаратом, содержащим все незаменимые аминокислоты и легко перевариваемым, является, например лактальбумин. Белки, не содержащие какую-либо незаменимую аминокислоту, не обладают биологической ценностью. Растительные белки менее ценны, чем животные (мясо, рыба, молоко и т.д.), так как бедны лизином, метионином и триптофаном, а также труднее перевариваются. В организме могут синтезироваться только некоторые аминокислоты (заменимые), а те которые не синтезируются, называются незаменимыми. Для детей до 3-месячного возраста их 10: лейцин, изолейцин, лизин, треонин, триптофан, фенилаланин, гистидин, цистин, аргинин, валин. У взрослого организма 8 аминокислот являются незаменимыми (аргинин и гистидин – условно заменимые).

2.2. Нормы белка в питании у детей. Азотистый баланс, его виды, значение.

Основная масса азота в пище приходится на белки. При обмене белка, содержащийся в нем азот выделяется из организма в виде азотистых веществ. Для изучения и понимания хода и состояния обмена белков большое значение имеет определение азотистого баланса – это разница между количеством поступившего в организм азота и выведенного в виде конечных азотистых продуктов.

Виды азотистого баланса:

«положительный» – если азота выведено меньше, чем введено, т.е. азот задерживается в организме (в норме это имеет место у беременных, в растущем организме). При этом происходит накопление белков в тех или иных органах и тканях.

«нулевой» – азотистое равновесие.

«отрицательный» – если азота выведено больше, чем введено. Это значит, что в организме идет распад белков органов и тканей (сахарный диабет, ожоги, злокачественные новообразования и др.), который не компенсируется белками пищи. Он наблюдается при заболеваниях, связанных с усиленным распадом белков тканей, в старческом возрасте.

Коэффициент изнашивания – это результат ежесуточного распада тканевого белка, который равняется 23,2 г. Определен он был на добровольцах, у которых на 8-10 день безбелковой диеты начинает выделяться постоянное количество азота (53 мг в сутки на 1 кг массы тела).

Определив физиологический минимум белка, равный 30-45 г в сутки, при котором в организме устанавливается азотистое равновесие, ученые научно обосновали и рекомендовали суточную потребность белка, равную 100-120 г. Одинаково она зависит от многих факторов: возраста, вида выполняемой работы, физиологических и патологических состояний и т.д. Потребность в белке у детей: 1-3 года – 4,0 г/кг массы, 11-13 лет – 2,5 г/кг массы, 14-17 лет – 1,8 г/кг массы.

2.3. Переваривание белков и всасывание аминокислот в желудочно-кишечном тракте. Нарушение

переваривания белков и всасывания аминокислот.

Переваривание белков в ЖКТ следует рассматривать как начальный этап обмена веществ, при котором белки лишаются видовой специфичности и в виде аминокислот усваиваются организмом. Фермент ЖКТ осуществляет поэтапное расщепление пептидных связей белковой молекулы.

Протеазы, гидролизующие пептидные связи внутри белковой молекулы относятся к эндопептидазам: пепсин, ренин (у детей) гастриксин, трипсин, химотрипсин, эластаза – синтезируются в неактивной форме. Механизм активирования связан с отщеплением концевого пептида, приводящее к формированию трехмерной структуры и образованию активного центра ферментов. Трипсин разрывает пептидные связи, образованные основными аминокислотами: лизином и аргинином, пепсин – между циклическими аминокислотами, ренин створаживает молоко.

Ферменты, гидролизующие пептидную связь, образованную концевыми аминокислотами относятся к экзопептидазам: карбоксипептидазы синтезируются в виде предшественников в поджелудочной железе, содержат Zn, разрывают пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами.

Переваривание белков начинается в желудке. Большую роль в этом процессе занимает соляная кислота. Белки, поступающие в желудок, стимулируют выделение гистамина и группы белковых гормонов – гастринов, которые вызывают секрецию соляной кислоты (образуется в обкладочных клетках желудочных желез) и профермента пепсиногена. Под действием соляной кислоты происходит денатурация белков пищи, не подвергшихся термической обработке. НСl обладает бактерицидным действием и препятствует попаданию патогенных бактерий в кишечник. Она активирует пепсиноген и создает оптимум рН для действия пепсина.

Желудочное содержимое (химус) в процессе перевариваня поступает в двенадцатиперстную кишку. Низкое значение рН химуса вызывает в кишечнике выделение секретина, поступающего в кровь. Он стимулирует выделение из поджелудочной железы в тонкий кишечник панкреатического сока, содержащего НСО₃^- , что приводит к нейтрализации НСl желудочного сока и ингибированию пепсина (рН резко возрастает от 1,5-2,0 до 7,0).

Поступление пептидов в тонкий кишечник вызывает секрецию холецистокинина, который стимулирует выделение панкреатических ферментов с оптимумом рН 7,5 – 8,0. Под действием ферментов поджелудочной железы и клеток кишечника завершается переваривание белков.

Под влиянием протеолитических ферментов образуются аминокислоты, которые всасываются в кишечнике, либо диффузно, либо путем активного транспорта.

НАРУШЕНИЕ ПЕРЕВАРИВАНИЯ И ВСАСЫВАНИЯ БЕЛКОВ.

При различных заболеваниях ЖКТ в желудке нарушается выделение НСl и пепсиногена, при этом заметно снижается переваривание белков. Наиболее часто встречаются патологические изменения кислотности желудочного сока.

Повышенная кислотность (норма 40-60ТЕ) желудочного сока сопровождается изжогой, диареей и может быть симптомом язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, гиперацидного гастрита.

Пониженная кислотность бывает при некоторых видах гастритов. Полное отсутствие НСl и пепсина (ахилия) наблюдается при атрофических гастритах.

Анацидность (рН >6) часто вызывает рак желудка.

У некоторых людей возникает иммунная реакция на прием белка, что связано со способностью к всасыванию негидролизованных коротких пептидов. Аминокислоты лишены антигенных свойств и иммунных реакций не вызывают.

У новорожденных проницаемость слизистой оболочки кишечника выше, чем у взрослых, поэтому в кровь могут поступать антитела молозива. Это усугубляется наличием в молозиве белка-ингибитора трипсина. Протеолитические ферменты в пищеварительных секретах новорожденных обладают низкой активностью. Это способствует всасыванию в кишечнике небольшого количества нативных белков, достаточного для обеспечения иммунной реакции. Подобное усиление всасывающей способности кишечника является причиной непереносимости белков пищи (молока, яиц) у взрослых людей.

При заболевании целиакии (нетропической спру) происходит нарушение клеток слизистой оболочки кишечника, где всасываются небольшие негидролизованные пептиды. Целиакия характеризуется повышенной чувствительностью к глютену (белок клейковины зерен злаков), который оказывает токсическое действие на слизистую тонкой кишки, что приводит к ее патологическим изменениям и нарушению всасывания.

2.4. Гниение белков в кишечнике. Пути использования аминокислот в организме после всасывания.

Гниение белков в кишечнике: под влиянием микрофлоры нижнего отдела кишечника некоторые аминокислоты могут подвергаться превращениям до аминов, жирных кислот, спиртов, фенолов, сероводорода и др.

Общее направление этих реакций:

1. При декарбоксилировании аминокислот возможно образование соответствующих нередко ядовитых аминов.

2. При дезаминировании возникают насыщенные и ненасыщенные кислоты, кетокислоты, оксикислоты.

Путресцин образуется при декарбоксилировании орнитина, а кадаверин – из лизина. Они относятся к группе трупных ядов. Выводятся из организма через почки с мочой почти в неизменном виде. Выделение путресцина и кадаверина с мочой наблюдается при холере, дизентерии и т.д.

Фенол и крезол образуются из тирозина. После всасывания они обезвреживаются в печени. Происходит это либо за счет связывания с Н₂SО₄, либо с глюкуроновой кислотой. В результате образуются парные серные-, фенол- или крезолглюкуроновые кислоты. Они называются еще эфиро-серными кислотами и являются постоянными составными частями мочи. Серная кислота присоединяется в виде активной формы, формируя фосфоаденин фосфосульфат (ФАФС), глюкуроновая кислота – уридиндифосфат глюкуроновой кислоты (УДФГК).

Индол и скатол образуется при декарбоксилировании из триптофана. Они обусловливают специфический запах кала, являются ядовитыми веществами и обезвреживаются в печени. Индол связывается в виде эфирсерной кислоты калиевая соль этой кислоты получила название животного индикана, который выводится с мочой и по его количеству судят не только о скорости процесса гниения, но и о функциональном состоянии печени.

Пути использования аминокислот после всасывания:

1. Синтез специфических белков тканей, плазмы крови, ферментов, гормонов.

2. Синтез углеводов (глюконеогенез).

3. Синтез липидов.

4. Синтез гистамина, серотонина, креатина, порфиринов, холина, адреналина, пуриновых, пиримидиновых нуклеотидов.

5. Синтез мочевины.

6. Оставшиеся неиспользованные аминокислоты подвергаются распаду с выделением энергии (10-15%).

Общие пути распада аминокислот:

1. Декарбоксилирование;

2. Трансаминирование;

3. Дезаминирование;

2.5. Декарбоксилирование и трансаминирование, биологическое значение. Диагностическое значение

определения активности трансаминаз.

Декарбоксилирование – процесс отщепления группы СО₂ при участии декарбоксилаз, небелковый компонент которых пиридоксальфосфат (ПФ), активная форма витамина В₆. Реакции декарбоксилирования необратимы. Их продуктами являются СО₂ и биогенные амины, которые выполняют функцию нейромедиаторов (серотонин, дофамин, ГАМК), гормонов (адреналин, норадреналин), регуляторных факторов местного действия (гистамин, карнозин и др.).

Гистамин – образуется путем декарбоксилирования гистидина в тучных клетках соединительной ткани. Секретируется в кровь при повреждении ткани (удар, ожог), развитии иммунных и аллергических реакций. Роль:

1. стимулирует секрецию желудочного сока, слюны;

2. повышает проницаемость капилляров, вызывает отеки, снижает АД (но увеличивает внутричерепное давление, вызывает головную боль);

3. сокращает гладкую мускулатуру легких, вызывает удушье;

4. участвует в формировании воспалительной реакции – вызывает расширение сосудов, покраснение кожи, отечность ткани;

5. выполняет роль нейромедиатора;

6. является медиатором боли.

Декарбоксилаза (ФП)

Серотонин – нейромедиатор проводящих путей. Образуется в надпочечниках и ЦНС из аминокислоты 5-окситриптофана. Он может превращаться в гормон мелатонин, регулирующий суточные и сезонные изменения метаболизма организма и участвующий в регуляции репродуктивной функции. Роль:

1. стимулирует сокращение гладкой мускулатуры;

2. оказывает сосудосуживающий эффект;

3. регулирует АД, температуру тела, дыхание;

4. обладает антидепрессантным действием;

5. принимает участие в аллергических реакциях.

декарбоксилаза

5-окситриптофан серотонин

ФП

γ-аминомаслянная кислота (ГАМК) – образуется путем декарбоксилирования глутаминовой кислоты. Основной тормозной медиатор высших отделов мозга. Роль:

1.увеличивает проницаемость постсинаптических мембран для ионов К⁺, что вызывает торможение нервного импульса;

2. повышает дыхательную активность нервной ткани;

3. улучшает кровоснабжение головного мозга.

ГАМК в виде препаратов гаммалон или аминалон применяют при сосудистых заболеваниях головного мозга (атеросклероз, гипертония), нарушениях мозгового кровообращения, умственной отсталости, эндогенных депрессиях, травмах головного мозга, эпилепсии.

СО₂

COOH-CH₂-CH₂-CH(NH₂)-COOH COOH-CH₂-CH₂-CH₂(NH₂)

Глутаминовая кислота ФП ГАМК

Трансаминирование – процесс переноса аминогруппы с α-аминокислоты на кетокислоту при участии ферментов трансаминаз (В6 – фосфопиридоксаль). Этому процессу подвергаются все аминокислоты, кроме лизина, треонина и пролина.

Реакцию трансаминирования катализируют высокоактивные аминотрансферазы: аланинаминотрансфераза (АЛТ) и аспартатаминотрансфераза (АСТ), которые обладают субстратной специфичностью.

АЛТ и АСТ – органоспецифические ферменты, в норме в крови их активнрсть равна 5-40 ЕД/л, т.е. активность трансаминаз сравнительно низкая. При заболеваниях, сопровождающихся деструкцией (некрозом) клеток, происходит выход ферментов в кровь и повышение их активности. Определение активности АЛТ и АСТ имеет большое диагностическое значение. Для дифференциальной диагностики заболеваний печени и сердца определяют соотношение активности АСТ/АЛТ в сыворотке крови – «коэффициент де Ритиса», который в норме составляет 1,33±0,42.

При гепатитах активность АЛТ увеличивается в 6-8 раз по сравнению с нормой, а АСТ – в2-4 раза. «Коэффициент де Ритиса» уменьшается примерно до 0,6. Особенно важное значение для диагностики имеет повышение активности АЛТ при безжелтушных формах вирусного гепатита. У детей при гепатитах активность АЛТ возрастает еще в дожелтушный период развития болезни. Однако, при церрозе печени «Коэффициент де Ритиса» приближается к 1,0, что свидетельствует о некрозе клеток, при котором в кровь выходят обе фракции (цитоплазматическая и митохондриальная).

При инфаркте миокарда активность АСТ увеличивается в 8-10 раз, а АЛТ – в 1,5 -2,0 раза. Значение «Коэффициента де Ритиса» резко возрастает. Инфекционные и токсические миокардиты характеризуются повышением АСТ, это же самое наблюдается при операциях на сердце.

При стенокардии, пороках сердца, инфаркте легкого активность аминотрансфераз в крови не возрастает.

2.6. Дезаминирование окислительное и непрямое аминокислот.

Дезаминирование – процесс потери аминокислотой аминогруппы. В организме подвергается этому процессу только глутаминовая кислота, т.к. в организме активен фермент глутаматдегидрогеназа (ГДГ). Фермент ГДГ активен в митохондриях клеток всех органов, кроме мышечной ткани.

1. Окислительное дезаминирование.

NН

СООН – СН₂ – СН₂ – С – СООН

НООС–СН₂- СН₂ - СН – СООН

NН₂

О

ГДГ +НОН СООН-СН₂-СН₂-С-СООН

глутаминовая кислота иминоглутарат NН3 + -

α-кетоглутаровая кислота

НАД

НАДН₂

Остальные аминокислоты подвергаются непрямому дезаминированию.

2. Непрямое дезаминирование – это процесс дезаминирования путем трансаминирования.

3. Лабораторно-практические работы:

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИННОГО АЗОТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ НИНГИДРИНОВЫМ МЕТОДОМ.

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Свободные α-аминокислоты образуют с нингидрином фиолетовое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна количеству свободных аминокислот.

ХОД РАБОТЫ:

В центрифужную пробирку отмеривают 1 мл сыворотки и 1 мл 1Н СН3СООН, хорошо перемешивают, закрывают пробкой и кипятят 20 мин в водяной бане. Центрифугируют 20 мин 1500 об/мин. 0,4 мл центрифугата помещают в мерные пробирки, затем прибавляют 4 мл фосфатного буфера (рН=6,8) и 0,5 мл 1% водного раствора нингидрина. Содержимое пробирки перемешивают и ставят в кипящую водяную баню. Окраска развивается в течение 40 мин, переходя от буровато-грязного цвета к лиловому и дальше к фиолетовому. Пробирки охлаждают и доводят объем дистил. водой до 7 мл. Колориметрируют при зеленом светофильтре в кювете шириной слоя 5 мл. Количество аминного азота находят по прилагаемой таблице. Норма составляет 2,96 ± 0,1 мг%.