Отбор, хранение и транспортировка пробы
Тема 1
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И САНИТАРНО
-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБЫ ВОДЫ ИЗ ПРУДА В БОРОВИКАХ
Цели работы:
1. Исследовать физико-химическое и санитарно-микробиологическое состояние пруда в Боровиках города Кирова.
2. Определить следующие показатели пробы воды:
- реакцию среды, окраску, запах пробы воды;
- общее микробное число (ОМЧ);
- общие колиморфные бактерии (ОКБ);
- термотолерантные колиморфные бактерии (ТКБ).
3. Сделать выводы:
- о соответствии полученных данных нормативам качества воды водных объектов;
- об интенсивности процессов самоочищения водоемов.
Оборудование:
- автоклав горизонтальный;
- термостаты электрические с автоматическим регулированием;
- холодильники бытовые, поддерживающие температуру на (4-6)°С;
- микроскоп «Микмед-2»;
- вакуумный насос;
- pH-метр;
- сушильный шкаф с регулированием температуры до 200°С;
- часы песочные на 1 минуту;
- весы лабораторные.
Лабораторная посуда:
- колбы различной емкости (100, 250, 500 и 1000 мл);
- чашки Петри бактериологические;
- шпатели стеклянные и металлические;
- стеклянные градуированные пипетки емкостью 1 и 10 мл;
- пеналы металлические для пипеток;
- стеклянные флаконы;
- стеклянные бактериологические пробирки;
- колба Бунзена для фильтрования под вакуумом;
- цилиндры емкостью 100, 250 и 500 мл;
- стаканы лабораторные;
- стекла предметные для микропрепаратов;
- пробки резиновые и ватно-марлевые;
- ложки пластиковые;
- металлический пинцет;
Реактивы:
- 0,9 % физиологический раствор хлорида натрия;
- сухая питательная среда Эндо промышленного производства;
- сухая питательная среда МПБ промышленного производства;
- агар-агар;
- карболовый раствор генцианвиолета;
- раствор Люголя;
- 96% этиловый спирт;
- раствор фуксина Пфейфера;
- промышленный набор для оксидазного теста;
- бумага фильтровальная.
Ход работы
Отбор, хранение и транспортировка пробы
Пробу воды для санитарно-микробиологического анализа отбирали на глубине 10-15 см от поверхности водоема в стерильные флаконы с резиновой пробкой. Пробу доставили для исследования в течение часа. Флакон с пробой промаркировали.
Таблица 1 – условия отбора пробы воды
| Дата отбора | 13.06.2017 |
| Место отбора | Пруд в Боровиках |
| Температура воздуха, °С | +18 |
| Ветер, м/с | 2, южный |
| Давление, мм.рт.ст. | |
| Влажность, % | |
| № подгруппы | |
| ФИО | Ковязина И.С. |
| Новикова О.А. | |
| Малинина А.И. |
Рисунок 1 – Пруд в Боровиках
Рисунок 2 – Отобранная проба воды
Определение физико-химических показателей исследуемой пробы воды
Определили запах исследуемой пробы воды при температуре
(15-20)°С. Для этого налили в колбу с широким горлом на 2/3 ее объема исследуемую пробу воды, встряхнули колбу вращательными движениями, втянули носом воздух из колбы. Затем колбу с пробой воды нагрели до 60°С, встряхнули и снова втянули носом воздух из колбы.
Определили показатель рН исследуемой пробы воды на лабораторном рН-метре.
Определение микробиологических показателей исследуемой пробы воды
Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе воды
Приготовили ряд последовательных разведений. Для этого в первую пробирку внесли стеклянной градуированной пипеткой 10 мл исследуемой воды из флакона (цельная проба). Объем засеваемой воды выбран с предположением, что водоем загрязнен сточными водами. В другие 4 пробирки внесли по 9 мл 0,9 % физиологического раствора хлорида натрия. Затем в первую пробирку с физиологическим раствором с помощью стеклянной градуированной пипетки внесли 1 мл исследуемой пробы воды, из этой пробирки уже новой пипеткой отобрали 1 мл и внесли в следующую и тд. Последняя пробирка соответствует концентрации 10-3.
Рисунок 3 – Схема приготовления разведений для определения ОКБ в пробе воды
Затем воду из всех разведений профильтровали с помощью вакуумного насоса. Для этого воронку протерли ватным тампоном, смоченным 96% этиловым спиртом. После высыхания спирта в воронку фильтровального аппарата положили фламбированным пинцетом стерильную фильтровальную бумагу. В воронку прибора для фильтрования наливали разведения, начиная с последнего, и создавали вакуум.
После окончания фильтрования и осушения фильтра отключали вакуум, фильтр осторожно поднимали за край фламбированным пинцетом и переносили его, не переворачивая, на питательную среду Эндо, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Чашки Петри подписали и поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа.
Для учета выбирали фильтры, на которых выросли изолированные типичные для лактозоположительных бактерий колонии: темно-красные, красные, с металлическим блеском и без него, слизистые с темно-малиновым центром с отпечатком на обратной стороне фильтра.
Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе воды
Пересеяли колонии с фильтров на чашки Петри со средой Эндо. Для этого разделили дно двух чашек Петри на 5 сегментов и в каждый из них пересеяли штрихом колонии, взятые с фильтров всех разведений. Чашки подписали. Одну из них поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа, другую при температуре 44°С на 24 часа. После инкубации описали колонии, сделали из них мазки и окрасили по Граму.
Провели оксидазный тест. Для этого стеклянной палочкой нанесли на бумажные тест-системы промышленного производства (с уже нанесенным на них реактивом) немного культуры. Реакцию считали положительной, если в течение 1 мин появлялось сине-фиолетовое окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не менялся.
Результаты
Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе воды
Колонии выросли на всех чашках, на чашке с цельным разведением сплошной рост (при расчете по формуле не учитывали).
Таблица 4 – Число колоний колиформных бактерий на среде Эндо
| № чашки | Концентрация | Количество колоний |
| Цельная проба | Сплошной рост | |
| 0,9 | ||
| 0,09 | ||
| 0,009 | ||
| 0,001 |
(1)
где X – концентрация, [КОЕ/мл]
X (ОКБ) = 
= 32 КОЕ/мл
Рисунок 4 – Цельная проба Рисунок 5 – Концентрация 0,9
Рисунок 6 – Концентрация 0,09 Рисунок 7 – Концентрация 0,009
Рисунок 8 – Концентрация 0,001
Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе воды
При температуре 37°С характерные для кишечной палочки малиновые колонии с блеском выросли из цельного разведения и из разведения с концентрацией 10-3. Из разведений с концентрацией 0,9, 0,09, 0,009 выросли колонии светло-розовые с блеском. Везде сплошной газон.
Таблица 5 – Колонии колиформных бактерий на среде Эндо при 37°С
| № сектора | Концентрация | Цвет колоний | Отношение к лактозе |
| Цельная проба | Малиновый | Лактозоположительные | |
| 0,9 | Светло-розовый | Лактозоотрицательные | |
| 0,09 | Светло-розовый | Лактозоотрицательные | |
| 0,009 | Светло-розовый | Лактозоотрицательные | |
| 0,001 | Малиновый | Лактозоположительные |
Рисунок 9 – Посев на среду Эндо при температуре 37°С
1 – цельная проба; 2 – концентрация 0,9; 3 – концентрация 0,09;
4 – концентрация 0,009; 5 – концентрация 0,001
После окраски мазков по Граму из культур, выросших при температуре 37°С обнаружены грамотрицательные короткие палочки во всех разведениях.
Препараты окрашены по Граму, объектив 100х
|
Рисунок 10 – препарат из
цельной пробы
|
Рисунок 12 – Препарат из
концентрации 0,09
Рисунок 14 – Препарат из концентрации 0,001
При температуре 44°С характерные для кишечной палочки малиновые колонии с блеском выросли только из концентрации 10-3. Сплошной рост.
Рисунок 15 – Посев на среду Эндо при температуре 44°С
1 – цельная проба; 2 – концентрация 0,9; 3 – концентрация 0,09;
4 – концентрация 0,009; 5 – концентрация 0,001
После окраски мазков по Граму из культуры, выросшей при температуре 44°С из концентрации 10-3 обнаружены грамотрицательные длинные палочки.
Рисунок 16 – Препарат из концентрации 0,001, окраска по Граму, объектив 100х
Оксидазный тест дал положительный результат у культуры с концентрацией 0,09, выросшей при температуре 37°С. У остальных культур оксидазный тест отрицательный.
Рисунок 17 – Оксидазный тест
1 – цельная проба; 2 – концентрация 0,9; 3 – концентрация 0,09;
4 – концентрация 0,009; 5 – концентрация 0,001;
6 – концентрация 0,001 (Т = 44°С)
Тема 2
Ход работы
2.1 Отбор пробы и предварительная обработка почвенного образца для анализа
Пробу почвы отбирали вблизи пруда в Боровиках на участке площадью 25 м2 в пяти точках по «конверту» (четыре точки по углам и одна в центре). Пробу отбирали стерильным скальпелем в специальный контейнер. Перед доставкой в лабораторию образец хранился при температуре (4-5)°С около 20 часов.
Рисунок 30 – Расположение места отбора пробы почвы на карте
Таблица 9 – условия отбора пробы почвы
| Дата отбора | 19.06.2017 |
| Место отбора | Боровики |
| Температура воздуха, °С | +19 |
| Ветер, м/с | 2, юго-западный |
| № подгруппы | |
| ФИО | Ковязина И.С. |
| Новикова О.А. | |
| Малинина А.И. |
Рисунок 31 – Отобранная проба почвы
Для приготовления среднего образца почву всех образцов с участка высыпали на бумагу, тщательно перемешали руками в стерильных перчатках. Убрали камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределили на листе ровным тонким слоем в форме квадрата.
Диагоналями почву разделили на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников убрали, а оставшуюся вновь перемешали, опять распределили тонким слоем и разделили диагоналями, два противоположных треугольника убрали, а оставшуюся почву вновь перемешали. Из этой почвы приготовили навеску массой 10 г. Керамическую ступку протерли 96% этиловым спиртом, высыпали в нее навеску почвы и растерли в 100 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Затем перелили во флакон. Флакон с пробой поставили в шейкер на 10 минут.
Рисунок 32 – Проба почвы в 100 мл физиологического раствора (1:10)
Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе почвы
Приготовили ряд десятикратных разведений. Для этого налили в 3 стерильные пробирки по 4,5 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Из первого разведения, находящегося во флаконе (концентрация 10-1) отобрали стерильной градуированной пипеткой 0,5 мл и перенесли в первую пробирку (концентрация 10-2), затем из нее перенесли 0,5 мл во вторую (концентрация 10-3). Для приготовления каждого разведения использовали стерильные пипетки.
Рисунок 33 – Схема приготовления разведений для определения ОКБ
Посеяли в чашки Петри на среду Эндо из разведений 10-2, 10-3, 10-4 по 0,1 мл суспензий. Чашки подписали, поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа. Учитывали отдельно выросшие колонии красного и малинового цвета. Колонии описали, сделали мазки и окрасили их по Граму.
Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе почвы
Произвели пересев колоний, выросших на среде Эндо при температуре 37°С методом штриха также на среду Эндо. Чашку подписали, поставили в термостат при температуре 44°С на 24 часа. Учитывали колонии красного и малинового цвета.
Результаты
Определение общих колиформных бактерий (ОКБ) в исследуемой пробе почвы
Таблица 10 – Число колоний на среде Эндо при температуре 37°С
| № чашки | Концентрация | Количество колоний |
| 10-2 | ||
| 10-3 | ||
| 10-4 |
Для расчета концентрации ОКБ используется формула 1.
X (ОКБ) = 
= 1801,8 КОЕ/мл
Для пересчета концентрации ОКБ на 1 г сырой почвы:
, (3)
где Nc – количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы, [КОЕ/г];
Nc (ОКБ) = 
= 18018 КОЕ/г
Для пересчета концентрации ОКБ на 1 г сухой почвы:
, (4)
где:
N – количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы, [КОЕ/г];
Nc – количество клеток бактерий в г сырой почвы, [КОЕ/г];
C – влажность исследуемой почвы, [%].
Навеска влажной почвы имела массу 10 г, после высушивания масса составила 8,2 г, следовательно, влажность исследуемой почвы 18%.
Коли индекс – количество КОЕ/л или КОЕ/г кишечной палочки
Коли индекс = 
[КОЕ/г] (5)
Коли индекс = 
= 3,9 
КОЕ/г
Коли титр – наименьший объем, в котором содержится единица кишечной палочки.
Коли титр = 
[КОЕ/г] (6)
Коли титр = 
= 0,26 
КОЕ/г
Рисунок 35 – Концентрация 10-2 Рисунок 36 – Концентрация 10-3
Рисунок 37 – Концентрация 10-4
При температуре 37°С на чашках со средой Эндо выросли колонии двух типов:
1 тип: средние колонии; форма колоний – круглая; профиль колоний – выпуклый; край колоний – гладкий; структура колоний – однородная; консистенция колоний – жидкая; поверхность колоний – влажная, гладкая, блестящая с глянцем; прозрачность колоний – непрозрачные; цвет колоний – розовый. Окраска по Граму выявила мелкие грамотрицательные палочки.
2 тип: крупные колонии; форма колоний – неправильная; профиль колоний – выпуклый; край колоний – волнистый; структура колоний – неоднородная; консистенция колоний – густая, вязкая; поверхность колоний – влажная, гладкая, блестящая с глянцем; прозрачность колоний – непрозрачные; цвет колоний – розовый. Окраска по Граму выявила грамотрицательные кокки.
|
Рисунок 38 – препарат 1 типа
колоний
Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в исследуемой пробе почвы
При температуре 44°С на среде Эндо колоний не выросло. Это говорит о том, что в образце почвы нет термотолерантных колибактерий. Показатель ТКБ = 0.
Тема 1
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И САНИТАРНО
-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБЫ ВОДЫ ИЗ ПРУДА В БОРОВИКАХ
Цели работы:
1. Исследовать физико-химическое и санитарно-микробиологическое состояние пруда в Боровиках города Кирова.
2. Определить следующие показатели пробы воды:
- реакцию среды, окраску, запах пробы воды;
- общее микробное число (ОМЧ);
- общие колиморфные бактерии (ОКБ);
- термотолерантные колиморфные бактерии (ТКБ).
3. Сделать выводы:
- о соответствии полученных данных нормативам качества воды водных объектов;
- об интенсивности процессов самоочищения водоемов.
Оборудование:
- автоклав горизонтальный;
- термостаты электрические с автоматическим регулированием;
- холодильники бытовые, поддерживающие температуру на (4-6)°С;
- микроскоп «Микмед-2»;
- вакуумный насос;
- pH-метр;
- сушильный шкаф с регулированием температуры до 200°С;
- часы песочные на 1 минуту;
- весы лабораторные.
Лабораторная посуда:
- колбы различной емкости (100, 250, 500 и 1000 мл);
- чашки Петри бактериологические;
- шпатели стеклянные и металлические;
- стеклянные градуированные пипетки емкостью 1 и 10 мл;
- пеналы металлические для пипеток;
- стеклянные флаконы;
- стеклянные бактериологические пробирки;
- колба Бунзена для фильтрования под вакуумом;
- цилиндры емкостью 100, 250 и 500 мл;
- стаканы лабораторные;
- стекла предметные для микропрепаратов;
- пробки резиновые и ватно-марлевые;
- ложки пластиковые;
- металлический пинцет;
Реактивы:
- 0,9 % физиологический раствор хлорида натрия;
- сухая питательная среда Эндо промышленного производства;
- сухая питательная среда МПБ промышленного производства;
- агар-агар;
- карболовый раствор генцианвиолета;
- раствор Люголя;
- 96% этиловый спирт;
- раствор фуксина Пфейфера;
- промышленный набор для оксидазного теста;
- бумага фильтровальная.
Ход работы
Отбор, хранение и транспортировка пробы
Пробу воды для санитарно-микробиологического анализа отбирали на глубине 10-15 см от поверхности водоема в стерильные флаконы с резиновой пробкой. Пробу доставили для исследования в течение часа. Флакон с пробой промаркировали.
Таблица 1 – условия отбора пробы воды
| Дата отбора | 13.06.2017 |
| Место отбора | Пруд в Боровиках |
| Температура воздуха, °С | +18 |
| Ветер, м/с | 2, южный |
| Давление, мм.рт.ст. | |
| Влажность, % | |
| № подгруппы | |
| ФИО | Ковязина И.С. |
| Новикова О.А. | |
| Малинина А.И. |
Рисунок 1 – Пруд в Боровиках
Рисунок 2 – Отобранная проба воды