Бактериологический метод
Все материалы для исследования бактериологическим методом, как правило, содержат постоянную микрофлору, что практически делает невозможным выделить микобактерии в чистой культуре без предварительной обработки материалов. Исключением из этого правила является стерильно взятая спинномозговая жидкость.
С целью уничтожения сопутствующей микрофлоры и гомогенизации мокроты, гноя и других материалов применяют 10% раствор серной кислоты или 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия 1:1.
Жидкие материалы центрифугируют 30-40 мин, осадок обрабатывают серной кислотой в течение 20-30 мин, устанавливают рН среды в пределах 7,2-7,6 и высевают на среду Левенштейна - Йенсена и среду Финн-2. Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 37°С 3-4 недели. Пробирки со средами, в которые исследуемый материал вносили петлей и втирали в поверхность среды, размещают вертикально; в тех случаях, когда посевы делают пастеровской пипеткой, пробирки помещают в термостат в полугоризоптальном положении на 2-3 сут, а затем вертикально. Все пробки заливают расплавленным парафином или закрывают целлофановым колпачком и уплотняют резиновым кольцом.
Посевы просматривают раз в неделю. Все пробирки, в которых обнаружен рост посторонней микробной флоры, удаляют. Рост микобактерий туберкулеза обычно обнаруживается на 3-й неделе, но иногда через 2,5-3 мес.
Микобактерии туберкулеза формируют колонии на плотных питательных средах с характерными признаками. Они как правило, сухие, морщинистые, грубые (напоминают бородавки), обычно в R-форме. S-форма колоний с пигментацией желтого или оранжевого цвета при влажном росте свойственна другим микобактериям.
При учете результатов следует фиксировать обильность и сроки появления роста микобактерий. Эти показатели, определяемые в динамике, имеют эпидемиологическое и прогностическое значение.
Культуры микобактерий туберкулеза, выращенные на питательных средах, микроскопируют. В мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, образуются скопления кислотоустойчивых типичных микобактерий.
В молодых культурах, выделенных из организма больных, леченных антибактериальными препаратами, обнаруживают микроорганизмы с измененной формой (короткие палочки, неправильной формы шары).
В некоторых случаях исследуемый материал высевают на 3-4 пробирки жидкой питательной среды с плазмой крови донора или сывороткой крупного рогатого скота.
Результаты посева учитывают через 10 дней. Берут одну пробирку и стерилизуют, из осадка готовят мазки, фиксируют, окрашивают и микроскопируют. Отрицательный результат выдают только после инкубирования посевов в термостате в течение месяца. Посторонние микроорганизмы в таких питательных средах растут, размножаются в первые дни культивирования и вызывают помутнение жидкости.
Микобактерии, выращенные на жидкой питательной среде, пересевают в пробирки с плотной средой. В таких случаях положительные результаты возрастают, но продолжительность исследования увеличивается.
Микобактерии могут размножаться и образовывать микроколонии на стекле. Для этой цели готовят полоски обычного стекла 10 см длиной и 0,9-1 см шириной, моют, обезжиривают, сушат и стерилизуют.
Мокроту больного выливают в чашку Петри, выбирают гнойные комочки, наносят их на полоску стекла и растирают другой такой же полоской так, чтобы получились два мазка, занимающие 2/3 длины стекла. Стекла кладут на стерильную бумагу и подсушивают. Сухие мазки погружают на 15-20 мин в пробирки с 2% раствором серной кислоты, а затем 2-3 раза промывают дистиллированной водой и помещают в жидкую синтетическую или кровяную среду, в которую добавляют 10 ЕД/мл пенициллина. Мазок должен быть полностью покрыт питательной средой. Инкубируют в термостате при 37-38°С. Результаты учитываются на 1-й. 15-й и 30-й день. Каждый раз один такой мазок вынимают из пробирки, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю - Нильсену или аурамином и микроскопируют. Положительными будут посевы, в которых на стекле выявляются микроскопические колонии в виде "жгутиков", "кос" и "пауков".
Определение лекарственной устойчивости
микобактерий туберкулеза
Лекарственную устойчивость микобактерий туберкулеза определяют с помощью бактериологических методов перед началом лечения, затем спустя 3 мес и далее при продолжающемся выделении бактерий туберкулеза через каждые б мес. Это делают путем выращивания микобактерий на питательных средах с различным содержанием препарата, к которому определяют устойчивость, и на тех же средах без добавления его (контроль).
Определение лекарственной устойчивости может быть: а) прямое - посев соответственно обработанного патологического материала (мокрота, гной и т.д.) на среды, содержащие лекарственные препараты; б) непрямое - пересев предварительно выделенных чистых культур микобактерий туберкулеза на среды, содержащие лекарственные препараты.
Прямой способ более эффективен, но им можно пользоваться, если микобактерии обнаруживаются в материале бактериоскопически и содержатся в значительном количестве (1-5 палочек в поле зрения). Наиболее распространенными методами определения лекарственной устойчивости являются:
1) культивирование на плотных яичных средах;
2) микрокультивирование на стеклах;
3) глубинные посевы на полусинтетические среды;.
Результаты исследования учитывают по истечении определенного срока выращивания, достаточного для получения обильного роста в контрольных пробирках.
В остальных пробирках в зависимости от концентрации препарата и степени устойчивости к нему данного штамма микобактерии туберкулеза рост может быть различной интенсивности или к этому времени отсутствовать.
Лекарственно чувствительные штаммы дают рост в пределах определенных концентраций, различных для каждого препарата.
Штаммы, которые дают рост при соответственно более высоком содержании препаратов, относят к лекарственно устойчивым. Устойчивость определяют по макроросту на плотных и по микроросту на жидких средах. Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией антибактериального препарата (количество микрограммов в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается рост, приближающийся к росту в контроле.
В части случаев выявляется обильный типичный рост микобактерии в присутствии той или другой концентрации антибактериального препарата, а на среде, содержащей более высокие концентрации этого же препарата, рост может быть скудным в виде единичных макро- или микроколоний, что указывает на размножение только некоторых, более резистентных, особей данного штамма. В таких случаях отмечают как максимальную концентрацию препарата, при которой еще размножается основная устойчивая масса микробных особей, так и предельную - при скудном росте ("относительная устойчивость" см. таб.).
Оценка устойчивости микобактерий туберкулеза
к лекарственным препаратам
| Препарат | Устойчивые при росте на средах, содержащих препарат, мкг/мл | |
| плотная | жидкая | |
| Стрептомицин | ||
| Тубазид | ||
| ПАС | ||
| Циклосерин | ||
| Канамщии | ||
| Этионамид | ||
| Биомицин |
Биологический метод
Наиболее надежным методом выявления микобактерии туберкулеза в настоящее время является заражение морских свинок исследуемыми материалами. Содержащие постороннюю микрофлору исследуемые материалы обрабатывают 1% раствором серной кислоты в течение 20 мин (включая время центрифугирования), троекратно отмывают осадок физиологическим раствором. Мокроту, ткани предварительно гомогенизируют; мочу. промывные воды центрифугируют и для исследования берут осадок. Обработанный серной кислотой и отмытый материал эмульгируют в 1-2 мл физиологического раствора и вводят подкожно в область паха 2 морским свинкам массой 250-300 г. При малом количестве исследуемого материала животных заражают внутрнбрюшинно или интратестикулярно. Такой путь заражения повышает чувствительность метода, особенно в тех случаях, когда в материале содержатся слабовирулентные изониазидоустойчивые микобактерии туберкулеза.
Зараженных животных взвешивают каждые 5 дней; если заражение было подкожное, следует регулярно пальпировать лимфатические узлы в месте заражения. В положительных случаях у свинок уменьшается масса тела, к концу месяца пальпируются увеличенные лимфатические узлы, могут появиться свищи или язвы.
Активный процесс у подопытных животных выявляется аллергической пробой. Для постановки пробы необходимо удалить шерсть с наружной поверхности бедра и внутрикожно ввести туберкулин 1:10 в объеме 0,1 мл. Результаты реакции определяют через 24 и 48 ч. На месте введения туберкулина появляются гиперемия, папула и некроз - положительная реакция; умеренная гиперемия с небольшой папулой или без нее - слабоположительная; гиперемия меньше 5 мм в диаметре - отрицательная.
Местные патологические изменения, положительная аллергическая реакция и истощение дают основание для вскрытия н исследования внутренних органов морских свинок.
В случаях, если патологических признаков нет, подопытных животных вскрывают через 3 мес.
В отдельных случаях применяют метод "слепых" пассажей: органами зараженного животного, у которого процесс не был обнаружен, заражают интактную морскую свинку; на 4-5-м пассаже удается обнаружить микобактерии туберкулеза. Идентификацию микобактерий туберкулеза из очагов в органах и тканях подопытных животных проводят бактериоскопическим и бактериологическим методами.
В последние годы все шире практикуют метод интрацеребрального заражения белых мышей.