Морфология бактерий и дрожжей

1. Цель работы. Изучить устройство микроскопа, освоить технику приготовления препаратов и микроскопирования. Ознакомиться с основными морфологическими группами бактерий и дрожжей.

2. Основные положения.Микроорганизмами называют живые организмы микроскопических размеров. Из царства животных к микроорганизмам относятся простейшие (одноклеточные животные) и некоторые многоклеточные животные (коловратки и др.). Микромир царства растений представлен низшими грибами (дрожжи, плесени) и водорослями. Третье царство живой природы – царство бактерий– целиком входит в микромир.

Для наблюдения за микроорганизмами и изучения их морфологии (внешний вид, форма, строение) используют различные микроскопы. Наиболее широко применяются световые микроскопы, позволяющие наблюдать объект в проходящем свете. Максимальное увеличение таких микроскопов составляет 2000, что дает возможность рассмотреть самые мелкие бактерии (размером менее 0,5 мкм). Большинство бактерий имеют размер около 1 мкм. Так как человеческий глаз способен различать объекты размером около 100 мкм, то чтобы увидеть бактерии, увеличение микроскопа должно быть не менее 100.

Устройство монокулярного светового микроскопа показано на рис. 1.1.

От источника света лучи с помощью зеркала направляются в конденсор. Конденсор, состоящий из нескольких линз, собирает лучи (усиливает интенсивность освещения) и направляет их через отверстие в центре предметного столика на изучаемый объект (располагается в центре предметного столика). Пройдя через объект, световой поток поступает в объектив, а затем в окуляр и в глаз наблюдателя. Увеличение объективов и окуляров указано на их оправе. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и окуляра.

Освещенность объекта можно регулировать с помощью апертурной диафрагмы, положения конденсора и съемных фильтров. Для получения наибольшей освещенности фильтры не используют, диафрагму полностью открывают, а конденсор поднимают вверх. Кроме того, более высокую освещенность объекта дает применение вогнутого зеркала.

Рис. 1.1. Устройство микроскопа МБР-1:

1 – основание штатива; 2 – микрометрический винт; 3 – макрометрический винт; 4 – тубусодержатель; 5 – окуляр; 6 – наклонный тубус; 7 – винт, закрепляющий тубус; 8 – револьвер; 9 – объективы; 10 – винт, закрепляющий столик; 11 – предметный столик; 12 – винт, закрепляющий конденсор; 13 – конденсор; 14 – рукоятка для перемещения конденсора; 15 – рычаг регулировки апертурной диафрагмы; 16 – винты, перемещающие столик; 17 – светофильтр; 18 – зеркало (плоское и вогнутое)

Для установки освещения вращают зеркало, направляя свет от источника в конденсор, до тех пор, пока в верхней линзе конденсора (видна через отверстие в предметном столике) не появится яркое световое пятно.

При сборке микроскопа сначала вставляют (вкручивают) в гнезда револьверного механизма объективы, а затем вставляют в наклонный тубус окуляр.

Препарат размещают в центре предметного столика. Для настройки на резкость сначала устанавливают в рабочее положение (вертикально) объектив с увеличением 8 и вращают макрометрический винт (резкое изображение появляется, когда нижняя линза объектива находится на высоте около 1 см от поверхности предметного столика). Более точно фокусировку обеспечивают с помощью микрометрического винта.

После получения резкого изображения объекта на объективе 8 можно перейти к работе с объективом, имеющим увеличение 40. Для этого вращают револьвер и ставят объектив 40 в рабочее положение, а затем добиваются резкого изображения с помощью микрометрического винта (при объективе 40 макрометрическим пользоваться нельзя). После перехода на объектив 40 необходимо увеличить освещенность объекта (поднять конденсор).

Для просмотра различных полей зрения перемещают предметный столик с помощью винтов 16 (см. рис. 1.1). Кроме того, предметный столик можно вращать, если предварительно ослабить винт 10. При использовании объектива с увеличением 8 можно передвигать сам объект, придерживая его за края предметного стекла.

Для работы с иммерсионным объективом (увеличение 90) на поверхность покровного стекла наносят каплю иммерсионного масла (кедровое масло), в которую затем погружают объектив. Использование кедрового масла позволяет избежать рассеяния света, возникающего из-за преломления световых лучей при переходе из стекла в воздух (рис. 1.2). В результате удается получить хорошую освещенность.

Рис. 1.2. Ход лучей в иммерсионной (сплошная линия) и сухой (пунктирная линия) системах:

1 – линза объектива 90; 2 – покровное стекло; 3 – водная суспензия микроорганизмов; 4 – предметное стекло; А, В, С – световые лучи от конденсора; n – показатель преломления света (для желтых лучей)

Поле зрения светового микроскопа МБР-1 представляет собой круг, диаметром (визуально) 120 мм. При увеличении 600 (объектив 40, окуляр 15) фактический диаметр поля зрения 200 мкм, а при увеличении 120 (объектив 8, окуляр 15) – 1000 мкм. При оценке размеров бактерий и дрожжевых клеток можно использовать масштаб: 1 мм (визуально) – 2 мкм (при увеличении 600). Например, по визуальному замеру размер клетки 2 мм. Тогда фактический размер составит 4 мкм.

Клетки, внутри которых в световой микроскоп видно ядро, получили название эукариоты. Клетки, у которых ядро отсутствует, называют прокариотами. По современной классификации к прокариотам относятся все бактерии, к эукариотам – клетки растений и животных.

Большинство бактериальных клеток имеют форму сферы, цилиндра или спирали. Классификация бактерий по форме клеток показана на рис. 1.3. Дрожжевые клетки имеют, как правило, сферическую или эллипсоидальную форму; средний размер клеток около 5 мкм.

Рис. 1.3. Основные формы бактериальных клеток:

1 – кокки; 2 – диплококки; 3 – тетракокки; 4 – сарцины; 5 – стрептококки; 6 – палочки (одиночная клетка и цепочка клеток); 7 – вибрионы; 8 – спириллы; 9 – спирохеты

Задание.

1. Приготовить прижизненный препарат смешанной бактериально-дрожжевой культуры.

2. Выявить и зарисовать с указанием размеров основные и морфологические группы бактерий и дрожжевые клетки.

3. Оценить концентрацию бактерий и дрожжей.

Ход работы.

1. Приготовление прижизненного препарата.

На предварительно обезжиренное предметное стекло нанести пипетокй каплю микробной культуры (объем капли 0,05¸0,1 мл). Растекшаяся капля должна иметь диаметр около 1 см. Если капля не растекается, следует ее удалить и дополнительно обезжирить стекло (вымыть с мылом, протереть спиртом), в противном случае получится препарат, насыщенный пузырьками воздуха, что не позволит проводить микроскопирование.

Накрыть каплю покровным стеклом. Для получения хорошего препарата (без пузырьков воздуха) покровное стекло ставят под углом около 30 % на предметное стекло в сторону капли, пока не произойдет смачивание (рис. 1.4 б). После этого плавно опускают покровное стекло (см. рис. 1.4 в).

в

б

а

Рис. 1.4. Приготовление препарата (пояснения в тексте):

1 – покровное стекло; 2 – капля; 3 – предметное стекло

Если часть жидкости выдавливается из-под покровного стекла, то этот избыток аккуратно удаляют фильтровальной бумагой, не касаясь покровного стекла.

Приготовленный препарат размещается в центре предметного столика микроскопа и закрепляется зажимами.

2. Микроскопирование прижизненного препарата смешанной бактериально-дрожжевой культуры.

Настроить освещение, установить в рабочее положение объектив 8 (окуляр 15) и с помощью макрометрического винта добиться резкого изображения объекта (в виде точек видны дрожжевые клетки). Затем, повернув револьвер, поставить в рабочее положение объектив 40 и сфокусировать изображение микрометрическим винтом.

Передвигая предметный столик, просмотреть препарат, выявить и зарисовать различные формы бактерий и дрожжей. Размеры клеток определить визуально по масштабу: 1 мм (визуально) – 2 мкм.

3. Оценка концентраций бактерий и дрожжей.

Оценить среднее расстояние между дрожжевыми клетками ( ), и клетками бактерий ( ), рассчитать концентрацию клеток по формулам:

; ,

где – мкм; – 1/мл.

Для оценки концентрации микроорганизмов в единицах абсолютно сухого веса (а.с.в.) следует определить средний объем клеток бактерий и дрожжей. При этом дрожжевые клетки можно аппроксимировать сферой, диаметром . Тогда объем дрожжевой капли:

, мкм³.

При плотности клетки =0,1 г а.с.в./см³ масса дрожжевой клетки составит:

, г.

Концентрация дрожжевых клеток:

, г а.с.в./л.

Среднюю массу бактериальной клетки можно принять равной 4×10^-13 г. Тогда концентрация бактерий:

, г а.с.в./л.

Общая концентрация микроорганизмов:

.

Лабораторная работа № 2