Ж. Особенности репликации вирусов

1.Двунитчатая ДНК - обычная полуконсервативная репликация.

2.Однонитчатая ДНК. Ее репликация происходит через стадии репликативной формы и промежуточной репликативной формы.

3.Однонитчатая РНК. Репликация происходит через две стадии.
Вначале на вирионной РНК (в РНК) синтезируются комплементарные РНК
(кРНК). Затем на кРНК синтезируются вирионные РНК.

4.Репликация однонитчатой РНК ретровирусов происходит с участием обратной транскриптазы. Вначале на вРНК обратная транскриптаза синтезирует минус-цепь ДНК, а затем на ней синтезирует плюс-нить ДНК. Двунитевая ДНК служит матрицей для синтеза вРНК.

5.Размножение вируса гепатита В также протекает с участием обратной транскриптазы. Вначале клеточная РНК-полимераза синтезирует на вирусной ДНК прегеномную РНК, а затем вирусная ревертаза синтезирует на ней минус-цепь ДНК, на которой затем достраивает плюс-цепь ДНК.

Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний

1.Вирусоскопический - обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптических микроскопов внутриклеточных включений.

2.Обнаружение вирусов с помощью методов иммуноэлектронной микроскопии.

3.Вирусологические методы - выделение чистых культур вирусов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.

4.Серологические методы - обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, реакций иммуноферментного метода (ИФМ), радиоиммунного метода, (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах),реакций преципитации в агаре, имлунофлуоресцентного метода. В принципе эти реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных ан­тигенов.

5.Биологические методы - заражение чувствительных к данному вирусу лабораторных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.

ЗАНЯТИЕ 2

Дата________________

Тема: МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ (окончание).

План занятия

1.Культивирование вирусов в культурах тканей (окончание):

а)изучение цитопатического эффекта - макро- и микроскопии культур клеток, зараженных вирусом осповакцины;

б)выявление размножения вирусов в культуре ткани реакцией гемадсорбции (демонстрация готовых препаратов);

в)обнаружение вируса в культуре ткани методом цветной пробы
(демонстрация;

г)выявление вируса в культуре ткани методом бляшек (демонстра­
ция);

д)обнаружение вируса в культуре ткани с помощью флуоресцирующих антител. Разбор методики.

2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе (окончание):

а)вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение измененийв них;

б)постановка реакции гемагглютинации;

в)определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Методические указания

§ I а)Цитопатическии эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие, выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.

б)Гемадсорбция - адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Зарисовать картину гемадсорбции.

в)Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 - оранжевый и при рН ниже 7 - желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

Цветные пробы зарисовать.

г)Метод бляшек предложен Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражаю вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.

Феномен бляшкообразования зарисовать.

Метод флуоресцирующих антител основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флуоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препарат промывают физиологическим раствором, подсушивают и фиксируют в ацетоне при 4⁰ в течение 10 минут. Затем препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой в течение 30 минут при 37⁰. После окраски препарат промывают физиологическим раствором и высушивают. Просмотр препарата производят с помощью люминесцентного микроскопа.

§2. Вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях, Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают, снимают колпачок и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлупную обо­лочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную обо­лочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в стерильную пробирку.

Для исследования хорионаллантоисной оболочки из яйца удаляют все содержимое. Оболочка остается на внутренней поверхности скорлупы или выпадает вместе с содержимым яйца. Оболочку осторожно вынимают пинцетом, помещают в чашку Петри, промывают физиологиче­ским раствором, тщательно расправляют и рассматривают на темном фоне изменения, имеющиеся в ней. Изменения на оболочке строго специфичны. Например, вирус осповакцины вызывает образование многочисленных беловатых втянутых в центре бляшек.

Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 минут.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) может быть использована для определения типа ви­руса или типа и титра антител. Для определения типа вируса на пред­метное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 минут. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или анти­тел (антигемагглютининов).

Рис.1.Культура клеток, зараженная вирусом осповакцины (цитопатический эффект)

Рис.2 Реакция гемадсорбции. Окраска по Романовскому.

Рис.3 Реакция гемагглютинации 1-опыт; 2-контроль.

К капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, прибавляют каплю 5%-ной взвеси куриных эритроцитов.

Рис.4 Метод цветных проб 1-Культура ткани, не зараженная вирусом; 2-Культура ткани, зараженная вирусом.

Рис.5 Культура ткани, зараженная вирусом полиомиелита (феномен бляшкообразования)

Рис.6 Схема определения типа вируса реакцией торможения гемагглютиниции.

В капле вируссодержащей жидкости прибавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов. К-контроль(эритроциты+физиологический раствор).

Контрольные вопросы

Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани?

Почему при размножении вируса цвет среды не изменяется?

С какой целью может быть использован метод цветных проб?

Какие изменения наступают в клетках при размножении вируса?

Как ставят реакцию гемадсорбции? Как выглядит положительная реакция гемадсорбции?

Что собой представляет метод бляшек?

Как обнаруживают вирус гриппа в курином эмбрионе?

Как вскрывают зараженный эмбрион?

Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутст­вии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции?

Что такое реакция торможения (нейтрализация) гемагглютинации? Для чего она используется?

Как обнаруживают изменения в хорионаллантоисной оболочке, вы­званные вирусом?