Микробиологическая диагностика. Основной метод исследования – бактериологический

Основной метод исследования – бактериологический. Объектами исследования служат фекалии, рвотные массы, желчь, секционный материал, мухи, вода, ил, гидробионты, сточные воды. Транспортная среда: 1% пептонная вода с pH 8,2-8,6, правила транспортировки соответствуют особо опасным инфекциям.

Серологический метод

а) сероидентификация: ИФА, РИФ, РПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом (РТПГА для подтверждения РПГА), РА с О, OR, 0139 антисыворотками

б) серодиагностика: РА, РПГА с эритроцитарным холерным диагностикумом РНАг, реакция лизиса, ИФА (для ретроспективной диагностики, выявления вибрионостителей, оценки поствакцинального и постинфекционного иммунитета).

Ускоренные методы: РИФ, ДНК-зонды, ПЦР, иммобилизация вибрионов О-холерной сывороткой и бактериофагом.

Необходимо идентифицировать и дифференцировать от V. parahaemolyticus, V.vulnificus, V.alginoluticus, V.mimicus, V.damsela, V.metschnigovii, V.proteus (finglepriori), V.albensis.

Предварительный положительный ответ при диагностике холеры выдается через 5-6 часов на основании обнаружения в посевах культур, агглютинирующихся на стекле холерной О-сывороткой, в разведении 1:100 и типовой сывороткой Огава или Инаба (1:50), и при положительном результате ускоренных методов исследования (ИФА, РИФ, микроагглютинации, РПГА, реакции иммобилизации).

Окончательный положительный ответ выдается через 18 -48 часов на основании выделенных культур, имеющих типичные морфологические признаки с учетом данных развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О, OR, Огава, Инаба, пробы с холерными диагностическими фагами; принадлежности к 1 группе Хейберга.

Профилактика:

а) неспецифическая – раннее выявление больных и носителей;

- усиление санитарно-гигиенического надзора;

- санитарно-просветительская работа;

- введение карантинных мероприятий

б) специфическая – вакцинация по эпидемиологическим показаниям.

Используют вакцины:

- химическая вакцина из штаммов классического вибриона и V. eltor;

- холероген – анатоксин;

- холероген-анатоксин в сочетании с О-антигеном холерного вибриона Инаба и Огава (химическая энтеральная бивалентная вакцина)

- убитая вакцина из штаммов Огава и Инаба;

- убитая вакцина из штаммов вибриона Эль- Тор;

Лечение:

а) неспецифическое – восстановление водно- электролитного баланса;

- антибактериальные препараты: тетрациклин, левомицетин, ко-тримоксазал, фуразолидон и т.д.

б) специфическая – бактериофаги (существуют, но в практике не применяются).

Синегнойная палочка

История:

Открыта в 1862 году А. Люке, выделена и описана в 1872 году Дж. Шретером, чистую культуру выделил П. Жессар.

Таксономия:

Сем. Pseudomonadaceae

Род Pseudomonas

Вид P. aeruginosa

(Необходимо отметить, что P. mallei вызывает –caп, P. pseudomallei – мелиоидоз у животных; P. putida, P.fluorscens, P. cepacia и др. у человека).

Морфология.

Размеры 1-3 х 0,5 -1 мкм, подвижны (1 или 2 полярных жгутика), располагаются одиночно, попарно, в виде коротких цепочек, но чаще беспорядочно, могут формировать незавершенный фагоцитоз, много микроворсин образуют слизистое вещество, напоминающее капсулу «мукоидные штаммы»

Тинкториальные свойства: гр. –

Культуральные свойства:

1. Нетребовательная к питательным средам

а) в жидких средах образует серовато-серебристую пленку, старые культуры обр. мутность сверху вниз

б) на плотных средах формирует небольшие колонии 2-5 мм, выпуклые S- тип, иногда R-тип: плоские, неправильной формы с волнистыми краями и складчатой поверхностью в виде «маргаритки». Может быть феномен радужного лизиса - появление на поверхности колоний пленки, переливающейся всеми цветами радуги в отраженном свете (обусловлено действием б/фага и характерен только для P. aeruginosa)

в) на скошенном агаре – тонкий блестящий налет. Культура имеет специфический запах жасмина (ароматические вещества).

Характерным свойством является появление к концу первых суток сине-зеленого окрашивания колоний с последующим проникновением пигмента (пиоцианина) в питательную среду. Некоторые штаммы продуцируют красный (пиорубин) или коричнево-черный (пиомеланин), желтый (L- оксифеназин), зеленый (пиовердин или флюоресцен) пигмент.

2. Строгий аэроб.

3. t ° ф-р: 6-45 °С, оптимальная t ° - 37°С, но хорошо растет и при 42°С.

4. Время культивирования -24 часа.

Биохимические свойства:

1. Хемоорганотроф;

2. Образует триметиламин с запахом карамели или жасмина;

3. Каталаза положительный;

4. Синтезирует цитохромоксидазу (индолфенолоксидаза), т.е. оксидазный тест «+»;

5. Протеолит. активность высокая: разжижает желатин, свертывает сыворотку крови, гидролизует казеин; утилизируют гемоглобин, т.е. образуют на кровяном агаре зону B-гемолиза; расщепляет сок: валин, аланин, свертывает лакмусовое молоко и затем расщепляет сгусток, восстанавливают нитраты в нитраты и далее азота, но не образует индола и H₂ S.

6. Сахаролитическая активность низкая – окисляют только глюкозу с образованием глюконовой кислоты, реакция Фогеса – Проскауэраотрицательная (для идентификации среды «пестрого ряда» готовят с малым содержанием пептона ( до 0,1 %) и высокой концентрацией углеводов (до 2%). Тест Хью-Лейфсон «+» только с глюкозой в аэробных условиях.

Антигены: О-сом. Аг и Н-аг, М-а/г у некоторых штаммов О-антигенный комплекс: ЛПС + белки, групповой специфичностью обладает ЛПС – О1, О2 и т.д. до 20 серогрупп. Белковый компонент – общий для всех псевдомонад, т.е. родовой.

Н- антигенный комплекс – термолабильные белки низкой специфичности, обусловлен различиями в строении флагеллинов. Выявлено 15 серотипов: Н1, Н2 и т.д. (обнаружено только у живых подвижных штаммов, без воздействия дезинфицирующих и антимикробных средств).

Факторы патогенности:

1. Токсины:

а)эндотоксин - приводит к развитию пирогенной реакции, стимулирует воспаление;

б) энтеротоксин образуется редко, только при шанхайской или пятидневной лихорадке;

в) фактор проницаемости;

г) гистотоксин, лейкоцидин, гемотоксин у некоторых штаммов;

д) экзотоксин в виде комплекса:

· Экзотоксин А – термолабильный белок, высокотоксичный подавляет синтез белков через АТФ - рибозилирование и нарушением организации матрицы белкового синтеза, вызывает общий токсический эффект, отеки, некроз, артериальную гипотензию с последующим коллапсом, метабол. ацидоз, дыхательную недостаточность и т.д.

· Экзоэнзим S – термостабильный белок с АДФ-трансферазной активностью, в виде протоксина.

· Цитотоксин – действует на сегментоядерные нейтрофилы, повышает проницаемость клеточных мембран, происходит потеря белковых молекул, клетка набухает, нарушаются физиологические градиенты К⁺ , Na ⁺ , Са²⁺ и глюкоза, ультраструктурные изменения.

· Термолабильный гемолизин с лецитиназной. активностью (фосфолипаза С) и термостабильный гемолизин (фософлипаза), вызывают солюбилизацию и гидролиз фосфолипидов с образованием фосфорилхолинов – источник неорганических фосфатов.

Ферменты патогенности нейраминидаза; протеаза II (эластаза),действует на эластин, казеин, гемоглобин, фибрин, Ig (иммуноглобулулин), комплемент; протеаза III (щелочная протеаза) …на Y ИФН; коллагеназа (преимущественно действует на коллаген роговицы); лецитиназа.

Строение и химические компоненты

- жгутики;

-капсулоподобная слизь;

-бактериоцины (пиоцин, действует на гр + и гр- бактерии, обладает фунгицидным действием, проводят пиоцинотипирование в эпид. ситуациях)

Резистентность

Устойчивы, к УФЛ, антисептикам (фурацинол, риванол), в пыли сохраняются 2 недели, в кусочках ожоговых корочек – 8 недель; но погибают при 60°С в течение 15 минут, 55°С- 1 час; 2% фенол – мгновенно; обладают высокой резистентностью к антибиотикам, но чувствительны к бактериофагам.

Эпидемиология

Естественной средой обитания является кишечник человека и животных

Пути заражения: контактно-бытовой, алиментарный

Факторы: почва, вода, воздух.

Вызыв. ГВИ им ГСЗ в виде оппортунист шиф., т.е. у людей с низкой резистентностью и поврежденными анатомическими барьерами (Ожеговыми ранами). Отметить, что у ожоговых больных нейтрофилы теряют способность подавлять размножение синегнойной палочки.

Это внеклеточный паразит, БАВ защищает возбудителя.

М.б. эндогенная инфекция. Пищевые токстикоинфекция и ВБИ характеризуется высокой летальностью и устойчивостью к 6-8 антибиотикам из-за R плазмид. Клиника зависит от очага поражения.В 30% госпитализированных инфекций – синегнойная палочка в ассоциации с другими микробами: сафилококки, протей, кишечная палочка.

Иммунитет: постинфекционный (нестойкий, непродолжительный)

Лабораторная диагностика:

1. взятие материала. Из разных биотопов;

2. определение количественного содержания.

Профилактика:

а) неспецифическая: соблюдение санитарно-гигиенических норм;

б) специфическая: поливалентная корпускулярная инактивированная жидкая синегнойная вакцина; анатоксин синегнойной палочки; стафило-протейно-синегнойная адсорбированная жидкая химическая вакцина

- бактериофаг псевдомонадный в виде моно-, интести - ….комбинированного пиобактериофага.

Лечение:

а) неспецифическое - антибиотики, необходимо учитывать резист к антибиотикам, обусловленную блокадой транспорта препарата к внутриклеточной мишени и его инактив ферментами: β-лактамазы, ацетилтрансферазы, нуклеотидазы;

б) специфическое:

-бактериофаг;

-сыворотка, иммуноглобулин, плазма доноров;

- аутовакция

3. Протеи

История: в 1885 году Хаузер выделил P. mirabilis из гниющего мяса. Из-за способности проявлять различный рост на плотных средах подобно Богу Протею, меняющую свой облик, назван Proteus.

Таксономия:

Сем.Enterobacteriaceae

Триба , Proteae

Род Proteus

Виды: Р. vulgaris, Р.mirabilis, Р.penneri,

Р. Muxofaciens

(необходимо отметить, что Р. Morganii введен в род Morcanella Р. rettgeri и Р.stuartii в род Providencia)

Морфология: палочки, склонные к полиморфизму, размерами 1-3х0,4-0,8 мкм, имеют жгутики (перитрих), капсулу не образуют (некоторые штаммы - микрокапсулу), неспорообразующий.

Тинкториальные свойства: грам «-»

Культуральные. свойства:

1. Растут на простых питательных средах:

а) в жидкой среде – диффузное помутнение с последующим образованием осадка;

б) колонии протеев в О-форме на МПА (без жгутиков) круглые, выпуклые, полупрозрачные. Н-формы дают ползучий рост. Причем на агаре меньшей плотности при t° 20-22° C характерен «феномен роения» образование концентрических колец роста по периферии центральной колонии или однородная пленка по влажной поверхности питательной среды. Рост сопровождается гнилостным запахом. На среде Плоскирева формируют желтовато-розовые колонии (в зоне роста среда подщелачивается и желтеет); на висмут-сульфитном агаре через 48 часов образуют серо-коричневые колонии с черно-коричневой редукционной зоной, на Эндо и Мак Конки – бесцветные колонии; pH 7.2 – 7.4; при посеве в конденсационную воду скошенного агара по Шукевичу дают ползучий рост.

2. Факультативные анаэробы.

3. Температурный фактор от 10-43° С, оптим 35-37°С.

4. Время роста – 24 часа.

Биохимические свойства: D-глюкозу и некоторые углеводы: ксилозу, мальтозу сбраживают до кислоты и, обычно, газа в зависимости от вида, оксидаза – отрицательны, каталаза – положительны, не синтезируют лизиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу, дезаминируют фенилаланин и триптофан, гидролизуют мочевину, расщепляют тирозин, восстанавливают нитраты.

Антигенная структура: О -, Н -, К - антигены, различают несколько десятков сероваров, некоторые сероварыпротея: ОХ - штаммы, имеют перекрестнореагирующие антигены с риккетсиями.

Факторы патогенности:

1. Токсины:

- эндотоксин – ЛПС клеточной стенки;

- гемолизины обнаруживаются при инкубации более 48 часов, различают гемолизины двух типов:

1 типа (у 94-100% изолятов Р. mirabilis и 84-96% Р. vulgaris) образуется в начальный и средний периоды логарифмической фазы роста, проявляет цитотоксическое действие на эпителий мочевого пузыря, моноциты человека, культуру клеток Vero;

2 типа (у 98% изолятов Р. penneri и 8% Р. vulgaris) образуются в присутствии ионов Са²⁺,синтез детерминирован плазмидами, разрушают эритроциты, нейтрофилы, фибробласты человека с образованием пор и каналов в липидном бислое клеточных мембран.

2. ферменты: протеазы (повреждают IgА, IgG, повышают проницаемость сосудов, дезаминируют аминокислоты и действуют как сидерофоры), уреазы (бактерии разлагают мочевину в качестве источника энергии до хлорида аммония, который вызывает местное воспаление и повышает рН до значений, способствующих образованию кристаллов (струвитов), камней и застою мочи.

3. Структурные и химические компоненты клетки

- фимбрии (у Р. mirabilis выделены 2 типа пилей по отношению к маннозе: маннозозависимые и маннозонезависимые, вызывающие агглютинацию эритроцитов различных животных и человека);

- микрокапсула; белки наружной мембраны.

- способность к «роению» у вытянутых форм протея, дает возможность прилипать к паренхиме почечной ткани и эпителию мочевого пузыря; а палочковидные «плавающие клетки» выделяются из гнойных и серозно-гнойных экссудатов.

Резистентность: более устойчивы, чем Е. coli, участвуют в процессах гниения, размножаясь в органических субстратах; погибают при 60°С через 60 минут, 80° С – 5 минут, 1% р-р фенола – 30 мин.

Эпидемиология:

Источник: кишечник животных и человека, относится к условно-патогенным м/о. Механизм заражения - фекально-оральный, контактный.

Входные ворота: ЖКТ, ожоговые и другие раны.

Роль в патологии: пищевые токсикоинфекции, гнойно-воспалительные заболевания (особенно мочевыводящие пути), внутрибольничные инфекции, экзогенные и эндогенные (аутоинфция) инфекции при иммунодефицитных состояниях.

Патогенез: адгезия обеспечивает прямую колонизацию и опосредованное действие: при взаимодействии пилей с клеточными рецепторамиактивизируются цитокины (ИЛ-6, ИЛ-8), развивается воспаление, при попадании ИЛ-6 , Ил-8 в кровь развивается генерализация процесса.

Иммунитет: постинфекционный нестойкий, непродолжительный, видоспецифичны.

Лабораторная диагностика: применяются среды с тирозином и триптофаном, на которых м/о вызывают просветление за счет разрушения кристаллов тирозина и побурение среды, в присутствии триптофана; для идентификации прочих энтеробактерий используют способность дезаминировать фениналанин, который разлагается до фенилпировиноградной кислоты в присутствии с Fe Cl ₂ с окрашиванием среды в зеленый цвет; в отличие от бактерий родов Morganella и Providencia при росте протея на лизино-железном агаре происходит окрашивание среды в оранжево-красный цвет в присутствии хлорида железа из-за дезаминирования лизина и образования кетокислот.

Профилактика:

неспецифическая: соблюдение санитарно-гигиенических норм.

Специфическая: бактериофаг в виде моно- и комбинированного (интести –бактериофаг, пиобактериофага, коли-протейногобактериофага).

Лечение

неспецифическое: антибиотики_ ампициллин, цефалоспорин, фтор-хинолоны; специфич. – бактериофаги.

Практические задания для студентов:

Провести бактериологическое исследование крови при подозрении на тифо-паратифозное заболевание (метод гомокультуры).

III этап.

1. Учет ферментации углеводов на среде Ресселя и среде с маннитом.

2. приготовить мазок со скошенного агара, окраска по Граму, микроскопия.

3. Постановка РА с поливалентной сальмонеллезной сывороткой, монорецепторными сыворотками: 09; 02; 04; Hd.

4. Заключение.

Выполнить. Серологическое исследование крови больного при подозрении на тифо - паратифозное заболевание (реакция Видаля). 2 этап.

1. Учет реакции Видаля (см. протокол занятия № 4).

Определить холерный вибрион при иммерсионной микроскопии демонстрационного фиксированного мазка.

Изучить вакцины холерные (демонстрационные препараты).

Рекомендуемая литература:

Основная:

1. Борисов Л.Б. с соавт. Мед. Микробиология, вирусология, иммунология: Учебник/ Под ред. Л.Б. Борисова. А.М. Смирновой. – М.: Медицина. -1994.-с.322-325;с.293-296; 285-286.

2. Борисов Л.Б. Мед. Микробиология, вирусология, иммунология- М.: ООО « Мед. Информ. Агентство»-2002.- с.398-400; 409-412; 418-420.

3. Зыков М.П. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, иммунологии и вирусологии. М.: Медицина.-1977.-с.211-215.

4. Борисов Л.Б. Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейндлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по мед. микробиологии, вирусологии и иммунологии. Учебное пособие.- М.: Медицина, 1993-240с.

Дополнительная:

1. Воробьев А.А., Быков А.С. Микробиология: Учебник. – М.: Медицина-1994.-с. 183-186.

2. Поздеев О.К. Медицинская микробиология/ Под ред. Акад. РАМН В.И. Покровского.- М.: ГЭОТАР - МЕД.- 2001.- с.375-380; 343-348; 373-374.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Мед. микробиология, иммунология и вирусология. Учебник.- СПб « Спец. Литература», 1998.-с.394-401; 348-353.

Методические рекомендации рассмотрены и утверждены на кафедральном совещании от «_______»_________________2007 г. протокол № _________

Зав кафедрой микробиологии

с вирусологией и иммунологией,

д.м.н, профессор ____________________ А. И. Смирнова.