Основные микроскопические приборы

Ручная лупа

Ручная лупа представляет собой вставленную в оправу двояковыпуклую линзу. Лупа может быть небольшой (карманная лупа) или намного большего размера, как, например, лупа, используемая при анатомировании (лупа на штативе). Ручную лупу надо держать близко к глазу, а объект приближать к лупе до тех пор, пока не будет получено четкое увеличенное изображение. Если исследуемый объект зарисовывают, необходимо вычислить, во сколько раз он увеличен на рисунке.

Увеличение рисунка = Линейный размер рисунка/Линейный размер объекта. Например:6/2 = 3. Записывают – «х3».

Световой микроскоп

Устройство микроскопа:

Увеличение микроскопа
Линза объектива	Линза окуляра	Увеличение объекта
х10	х6	х60
х40	х6	х240
х10	х10	х100
х40	х10	х400

В микроскопе для получения увеличенного изображения очень мелких объектов используется увеличительная способность двух выпуклых линз.

Уход за линзами и стеклами:

Грязь (пыль, песчинки, жир и т. п.) – одна из главных проблем при работе с микроскопом, поэтому за чистотой линз и стекол приходится все время следить. Их можно протереть до работы, но если вы при работе заметили грязь, то попытайтесь устранить ее источник. Попробуйте, например, глядя в микроскоп, подвигать предметное стекло или повращать линзу окуляра. Если в обоих случаях грязное пятно останется на прежнем месте, значит грязь попала на линзу объектива или на зеркало, или на ту сторону линзы конденсора, которая обращена к источнику света.

Сначала попробуйте сдуть соринки, а затем, если грязь осталась, смахните ее кисточкой или кусочком ткани. Подышав на стекло или на линзу, чтобы увлажнить поверхность, протрите ее кусочком ткани насухо. (Для протирания линз следует использовать особую ткань, без малейших следов древесных волокон, так как они могут поцарапать линзу; подойдет, например, тряпочка для очков)

Если потребуется, линзу окуляра дляпротирания можно снять, а линзы объектива отвинтить. После протирания линз их необходимо сразу же вернуть на место, чтобы в микроскоп не попала пыль.

Основные правила:

1) держите предметное стекло с находящимся на нем препаратом за края и не трогайте пальцами покровное стекло;

2) никогда не касайтесь пальцами линз;

3) содержите в чистоте предметный столик.

4) прикрывайте микроскоп и предметные стекла в то время, когда вы ими не пользуетесь.

Настройка микроскопа для работы при малом увеличении.

1. Поставьте микроскоп на стол и сядьте в удобной позе. Расположите здесь же на столе все, что вам потребуется для работы. Исследуемый объект на предметном столике микроскопа должен быть освещен. Для этого пользуются специальным осветителем, светом от окна или от настольной лампы. В двух последних случаях используют вогнутую поверхность находящегося под предметным столиком зеркала. С помощью зеркала свет направляют через отверстие в предметном столике. Если имеется подходящий конденсор, то для направления света через него используют плоскую поверхность зеркала. Поле зрения должно быть освещено равномерно.

2. С помощью винта грубой настройки поднимите вверх тубус микроскопа и поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив с малым увеличением не попадет в паз тубуса (при этом раздастся щелчок). Увеличительная способность линзы обычно указана на ее оправе.

3. Положите препарат, который вы собираетесь рассматривать, так, чтобы прикрытый покровным стеклом исследуемый материал находился над серединой отверстия в предметном столике и свет проходил сквозь нею.

4. Глядя на предметный столик и препарат сбоку, опускайте тубус с помощью винта грубой настройки до тех пор, пока объектив с малым увеличением не окажется примерно в 5 мм от препарата.

5. Глядя в микроскоп, медленно приподнимайте тубус с помощью винта грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус.

6. Всегда фокусируйте микроскоп, перемещая тубус вверх, а не вниз. В противном случае легко повредить препарат.

7. Держите открытыми оба глаза и смотрите ими по очереди.

Затрудняет рассматривание препарата обычно либо то, что в фокусе оказывается пыль или грязь на поверхности покровного стекла, либо неверное положение линзы объектива (слишком далеко от препарата).

Перемещение препарата

Заметьте, в каком направлении смещается препарат, если передвигать предметное стекло влево и вправо, к себе и от себя. Это поможет вам локализовать определенные точки на препарате или следить за движущимся объектом.

Настройка микроскопа для работы при большом увеличении

1. При работе с объективом большого увеличения для создания достаточного освещения необходим искусственный свет. Для этого используют настольную лампу или специальный осветитель для микроскопа с матовой лампочкой. При работе с лампой накаливания необходимо между ней и микроскопом поместить лист бумаги. Поверните зеркало плоской поверхностью вверх так, чтобы свет, отражаясь, попадал в микроскоп.

2. Сфокусируйте конденсор, не убирая препарата с предметного столика. Поднимите конденсор так, чтобы расстояние между ним и предметным столиком было не более 5 мм. Глядя в микроскоп, поворачивайте винт грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус. Теперь наводите фокус конденсора до тех пор, пока изображение лампы не наложится точно на препарат. Поместите конденсор несколько вне фокуса так, чтобы изображение лампы исчезло. Теперь освещение должно быть оптимальным. В конденсор вмонтирована диафрагма. Ею регулируют величину отверстия, через которое проходит свет. Это отверстие должно быть открыто как можно шире. Таким образом достигается максимальная четкость изображения.

3. Поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив большого увеличения не попадет в паз. Если на малом увеличении фокус уже был установлен, то объектив большого увеличения автоматически установится приблизительно в фокусе. Тонкая фокусировка всегда производится движением объектива вверх с помощью винта тонкой настройки.

4. Если при движении объектива с линзами большого увеличения фокус не устанавливается, сделайте следующее: глядя на предметный столик сбоку, опускайте тубус микроскопа до тех пор, пока линза почти не коснется препарата. Следите за отражением линзы объектива на препарате и добивайтесь того, чтобы линза почти коснулась своего изображения.

5. Глядя в микроскоп и поворачивая винт тонкой настройки, медленно поднимайте объектив до тех пор, пока изображение не попадет в фокус.

Масляная иммерсия

Для того чтобы получить более сильное увеличение, чем при работе с обычным объективом большого увеличения (х400), необходимо использовать масляно-иммерсионную линзу. Способность линзы собирать свет в значительной степени усиливается, если между линзой объектива и покровным стеклом поместить жидкость. Жидкость должна иметь тот же коэффициент преломления, что и сама линза. Поэтому в качестве жидкости обычно используют кедровое масло.

1. Положите препарат на предметный столик и сфокусируйте изображение так же, как при работе с обычным большим увеличением. Вместо объектива с линзой большого увеличения установите объективе масляно-иммерсионной линзой.

2. Капните каплю кедрового масла на покровное стекло непосредственно над исследуемым объектом.

3. Снова сфокусируйте изображение теперь уже под малым увеличением, затем поворотом револьверной головки установите объектив с масляно-иммерсионной линзой так, чтобы его кончик касался капли масла.

4. Глядя в микроскоп, очень осторожно сфокусируйте линзу с помощью винта тонкой настройки. Помните, что фокусная плоскость линзы находится всего в 1мм от поверхности покровного стекла.

5. Кончив работу, сотрите с линзы масло мягкой тряпочкой.

Электронный микроскоп

Мельчайший объект, который можно увидеть, используя видимый свет, должен быть не менее 200 нм в диаметре (половина длины волны в сине-фиолетовой области спектра). Учитывая размеры некоторых клеток и клеточных органелл (о них мы говорили выше), легко понять, что, например, митохондрии (1мкм. или 1000нм) должны выглядеть в световом микроскопе просто как какие-то мелкие гранулы внутри клеток. Рибосомы же в нем вообще не видны. Следовательно, световой микроскоп не позволяет познакомиться с детальной структурой митохондрий, рибосом и других клеточных компонентов.

В электронном микроскопе вместо светового излучения используется пучок электронов. Электроны при определенных условиях они ведут себя как волны. В сравнении с видимым светом они обладают двумя важными преимуществами. Во-первых, у них чрезвычайно малая длина волны, и, во-вторых, поскольку они несут отрицательные заряды, их можно сфокусировать с помощью электромагнитных линз (электромагнитов). Электромагнитные линзы направляют пучок электронов точно так же, как стеклянные линзы направляют пучок световых лучей.

Электронный микроскоп дает возможность получить для биологических объектов увеличение порядка 250000. С некоторыми материалами удается достичь еще большего увеличения и теперь иногда получают даже изображения отдельных атомов.

Принцип действия и ограничения электронного микроскопа

Электронные микроскопы появились в 1930-х годах и вошли в повсеместное употребление в 1950-х.

В трансмиссионном (просвечивающем) электронном микроскопе электроны, прежде чем сформируется изображение, проходят сквозь образец. Такой электронный микроскоп был сконструирован первым.

Электронный микроскоп перевернут «вверх дном» по сравнению со световым микроскопом. Излучение полается на образец сверху, а изображение формируется внизу. Принцип действия электронного микроскопа в сущности тот же, что и светового микроскопа. Электронный пучок направляется конденсорными линзами на образец, а полученное изображение затем увеличивается с помощью других линз. В верхней части колонны электронного микроскопа находится источник электронов – вольфрамовая нить накала, сходная с той, какая имеется в обычной электрической лампочке.

На нее подается высокое напряжение (например, 50000В), и нить накала излучает поток электронов. Электромагниты фокусируют электронный пучок. Внутри колонны создается глубокий вакуум. Это необходимо для того, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения их с частицами воздуха.

Для изучения в электронном микроскопе можно использовать только очень тонкие срезы или частицы, так как более крупными объектами электронный пучок почти полностью поглощается. Части объекта, отличающиеся относительно более высокой плотностью, поглощают электроны и потому на сформировавшемся изображении кажутся более темными. Для окрашивания образца с целью увеличения контраста используют тяжелые металлы, такие как свинец и уран.

Электроны невидимы для человеческого глаза, поэтому они направляются на флуоресцирующий экран, который воспроизводит видимое (черно-белое) изображение. Чтобы получить фотоснимок, экран убирают и направляют электроны непосредственно на фотопленку. Полученный в электронном микроскопе фотоснимок называется электронной микрофотографией.

Преимущество:

I) высокое разрешение (на практике – 0,5 нм)

Недостатки:

1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;

2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;

3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;

4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

5) исследуемые образцы под действием пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.

Сравнение светового и трансмиссионного электронного микроскопов
	Трансмиссионный электронный микроскоп	Световой микроскоп
Излучение	Электроны	Свет
Длина волны	≈0,005 нм	400-700 нм
Максимальное разрешение на практике	0,5 нм	200 нм
Максимально полезное увеличение	х250000 (на экране)	х1500
Линзы	Электромагнитные	Стеклянные
Объект	Неживой, обезвоженный.	Живой или неживой
Относительно маленький или тонкий
Удерживается на маленькой медной сетке в вакууме	Лежит на предметном стекле
Распространенные красители.	Содержат тяжелые металлы. которые отражают электроны	Цветные красители
Изображение	Черно-белое	Обычно цветное

Сканирующий электронный микроскоп

Еще один тип электронного микроскопа – это сканирующий электронный микроскоп, в котором пучок электронов последовательно перемещается от точки к точке по поверхности объекта, а отраженные от поверхности электроны собираются и формируют изображение наподобие того, какое возникает на экране телевизора.

Преимущества:

1) видны детали строения поверхности;

2) детали видны с большей глубиной резкости, т. е. большая часть образца одновременно находится в фокусе. Это создает удивительный эффект трехмерности;

3) можно работать с образцами большего размера, чем в трансмиссионном электронном микроскопе.

Недостаток:

1) разрешающая способность (5-20 нм) ниже, чем у трансмиссионного электронного микроскопа (0,5 нм).

О современных разработках в области микроскопической техники

можно почитать в сборнике статей: «Микроскопия сегодня»