Питательные среды для культивирования гемофильных бактерий

Среды для выращивания гемофильных бактерий должны содержать специальные ростовые факторы. Для этого в основную среду крови добавляют свежий стерильный экстракт дрожжей или чистые препараты ростовых факторов: V- , Х-фактор.

Шоколадный агар. Содержит Х- и V-факторы. Агаровую питатель­ную среду (МПА, агар Хоттингера) расплавляют на водяной бане и, не охлаждая, добавляют в нее 10—15% по объему стерильной дефибринированной или нитратной крови лошади, барана или кролика. Пос­ле охлаждения питательной среды до 55—60°С содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают по чашкам или пробиркам.

Агар Левинталя. Содержит Х- и V-факторы. Готовят при изуче­нии морфологии колоний, так как шоколадный агар непрозрачен. В этом случае к расплавленной и затем охлажденной до 60°С агаровой среде добавляют, встряхивая, 10% стерильной дефибринированной или цитрированной крови барана или лошади. Кровь добавляют дробно (5—7 раз) при тщательном перемешивании питательной среды, флакон с которой в промежутках выдерживают на водяной бане с температурой 65°С. После внесения всего объема крови питательную среду нагревают до ки­пения и оставляют в кипящей воде в течение 5 минут. Затем среду выни­мают из водяной бани и 2-3 минуты выдерживают при комнатной темпе­ратуре. Процедуру прогрева среды повторяют три раза. Далее питатель­ную среду ставят на 2 ч на водяную баню при температуре 60°С для осаждения темных хлопьев свернувшейся крови. По истечении указан­ного срока осторожно, стараясь не взмучивать осадок, верхнюю прозрач­ную часть агара разливают по пробиркам или чашкам Петри.

Сывороточно-дрожжевой агар. Содержит V-фактор. К расплавлен­ному МПА или агару Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 5-10% сте­рильной сыворотки крови лошади, крупного рогатого скота, овцы, кролика и такое же количество дрожжевого экстракта.

Приготовление дрожжевого экстракта. 250 г прессованных пекарских дрожжей суспендируют до образования гомо­генной суспензии в 1 л дистиллированной воды. Суспензию в колбе из термостойкого стекла кипятят в течение 4—5 минут, непрерывно пере­мешивая. Микробную массу осаждают центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость сливают и сте­рилизуют, пропуская через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Полученный таким образом дрожжевой экстракт хранят в посуде из темного стекла при 4-5°С и используют в течение 8-10 суток после изготовления.

Среда с баккормилкой. Метод применяется для культивирования видов, рост которых зависит от наличия в среде V-фактора. Исследуе­мый материал (или изучаемую культуру) засевают газоном на сыворо­точной или кровяной МПА, можно на агар Хоттингера в чашки Петри. После этого по диаметру чашки крестообразно в виде непрерывной линии бактериологической петлей засевают «питающую» культуру бактерий. Чаще используют Е. coli или Staphylococcus albus, не облада­ющие гемолитическими свойствами. Эти виды бактерий в процессе роста выделяют V-фактор, который диффундирует в толщу агаровой среды. В зоне диффузии V-фактора, вблизи питающей культуры, так называемой «баккормилки», способны расти колонии гемофильных бактерий (сателлитный рост), нуждающиеся в V-факторе.

Среды с добавлением чистых препаратов Х- и V-факторов. Исполь­зуют препарат гемин (Х-фактор) и НАД (V-фактор). В питательную среду (плотную, жидкую) вносят растворы гемина, НАД или оба препарата, в зависимости от ростовых потребностей бактерий. При этом учитывают, что НАД термолаби­лен, его необходимо стерилизовать фильтрацией и добавлять в охлаж­денную до 45°С среду, а гемин термостабилен и выдерживает автоклавирование.

Среды с селективными свойствами используют для выделения гемофильных бактерий из загрязненного патологического материала.

Среда Controni с соавт. (1972). Предназначена для культивиро­вания Х- и V-фактор -зависимых видов бактерий. На чашке Петри с кровяным агаром (5% крови овцы) засевают по всей поверхности исследуемый материал. Затем на питательную среду помещают бумажный диск, пропи­танный раствором, содержащим 5% сапонина и 2 ЕД бацитрацина. Сапо­нин разрушает эритроциты, вокруг диска образуется зона гемолиза, и из крови, находящейся в агаре, освобождаются фактор Х и V-фактор, которые обеспечивают рост гемофильных бактерий. Бацитрацин подавля­ет рост бацилл.

Среда Chapin с соавт. (1983). Состоит из шоколадного агара, содер­жащего 5 мкг/мл ванкомицина, 300 мкг/мл бацитрацина и 1 мкг/мл клиндамицина. Данная среда неблагоприятна для различных видов бак­териальных контаминантов. Высеваемость гемофильных бактерий (Н. influenzae) в 10 раз выше, чем на обычном шоколадном агаре.

Среда Gilbride с соавт. (1983). Обладает ингибирующим действием на наиболее часто встречающиеся контаминанты (Е. coli, P. haemolytiса, Р. multocida, S. faecalis, S. aureus). Представляет собой триптозную среду с дрожжевым экстрактом, содержащую 1 мкг/мл кристаллвиолета, 1 мкг/мл линкомицина, 8 мкмг/мл спектиномицина, 128 мкг/мл бацитрацина.

Среда Pijoan с соавт. (1983). Рекомендуется использовать для подращивания Н. pleuropneumoniae перед высевом на плотную среду. Сос­тоит из сердечно-мозгового бульона с 5% лошадиной сыворотки, 5% дрожжевого экстракта, 100 мкг/мл ДПН, 0,5 мкг/мл линкомицина и 1,5 мкг/мл бацитрацина.

По данным Т. Little (1970), получены положительные результа­ты при выделении Н. pleuropneumoniae из контаминированного матери­ала на шоколадном МПА, содержащем 1:25 000 кристаллвиолета и 1,6 ЕД бацитрацина.