Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

Метод дисков

Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, помещают на газон исследуемой бактериальной культуры в чашке Петри, Посевы инкубируют в течение 16-24 часов, после чего учитывают результаты опыта по образованию зон задержки роста бактерий.

По диаметру зон задержки роста ориентировочно судят о степени чувствительности бактерий к антибиотикам. Зона задержки роста до 15 мм указывает на слабую, до 25 мм - на среднюю и свыше 25 мм - на высокую чувствительность. Более точные результаты получают при использовании метода серийных разведений.

Метод серийных разведений

Этот метод позволяет определить минимальную задерживающую концентрацию антибиотика для данного микроорганизма (МЗК) как на жидких, так и на плотных питательных средах.

МПБ разливают по 2 мл в серию пробирок. Готовят основной раствор антибиотика, для чего берут навеску антибиотика и растворяют в дистиллированной воде из расчета 1 мг антибиотика на мл растворителя.

Левомицетин предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 0,25 мл спирта на 1 мг антибиотика; после полного растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы раствор содержал в 1 мл 1 мг антибиотика.

Тетрациклин и окситетрациклин растворяют в сантинормальном растворе соляной кислоты из расчета 1 мл на 1 мг антибиотика.

Эритромицин сначала растворяют в чистом метиловом спирте из расчета 1 мл на 10 мг эритромицина. После растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор, содержащий в 1 мл 1 мг антибиотика.

Исходный раствор антибиотика в количестве 2 мл вносят в первую пробирку с МПБ, перемешивают и получают определенную его концентрацию.

Из первой пробирки 2 мл разведенного антибиотика переносят во вторую пробирку и после перемешивания переносят 2 мл в третью пробирку и т.д. до предпоследней, откуда 2 мл выливают. Последняя пробирка является контролем, в ней нет антибиотика и она свидетельствует о пригодности среды для роста культуры.

После разведения антибиотика во все пробирки вносят по 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Для этого используют 3-4-часовые или 18-часовые культуры, разведенные МПБ в 50 раз.

Пробирки помещают в термостат на 12-18 часов, но предварительные результаты можно учитывать через 6-8 часов.

По истечении необходимого срока инкубации определяют максимальное разведение антибиотика, которое еще подавляет рост культуры. Концентрация антибиотика в последней пробирке с видимой задержкой роста и представляет собой минимальную задерживающую концентрацию антибиотика (МЗК).

Штамм считается чувствительным к антибиотикам, если МЗК препарата для данного штамма соответствует концентрации этого препарата, создаваемой в организме.

ЗАНЯТИЕ 3

Дата__________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ КОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

(окончание).

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЩЙ (бруцеллез).

План занятия

А. Микробиологический диагноз кокковых инфекций (окончание).

I. Регистрация результатов определения чувствительности стафилококков к антибиотикам. .

Б. Микробиологический диагноз особо опасных инфекций (бруцеллез).

1.Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков из убитых культур бруцелл.

2.Бактериологическая диагностика бруцеллеза. Выделение гемокультуры (разбор).

3.Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Райта.

4.Ускоренный метод серологической диагностики бруцеллеза -реакция Хеддлъсона и др.

5.Опсоно-фагоцитарная реакция.

6.Аллергическая диагностика бруцеллеза.Постановка пробы Бюрне.

7.Демонстрация препаратов, применяемых для диагностики, профилактики и лечения бруцеллеза (диагностикум, бруцеллин, профилактическая и лечебная вакцины).

Методические указания

А. Микробиологический диагноз кокковых инфекций (окончание):

§ 1. Измерить и записать в таблицу диаметр зоны задержки роста стафилококка каждым антибиотиком. Сформулировать и записать вывод о степени чувствительности выделенной культуры к различным антибиотикам.

Б. Микробиологический диагноз особо опасных инфекций (бруцеллез).

§ 1. Приготовить, окрасить по Граму и промикроскопировать препарат из убитой культуры бруцелл. Обратить внимание на размеры микроорганизмов.

§ 3. Поставить реакцию Райта с сывороткой больного бруцеллезом по классической схеме пробирочной реакции агглютинации (см. Часть I, занятие 10-е). Диагностический титр реакции Райта - 1:200.

§ 4. На стекле размечают карандашом 4 квадрата размером 3x3 см каждый. Микропипеткой наносят в квадраты капли сыворотки объемом 0,04, 0,02 и 0,01 мл,в последний квадрат одну каплю (0,03 мл) физиологического раствора (контроль) . В каждую каплю другой микропипеткой добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума. Перемешивают капли стеклянной палочкой пли петлей, начиная с контрольной капли и идя от меньших количеств сыворотки к большим. Слегка подогревая и покачивая стекло, наблюдают за появлением агглютинации, которая должна наступать в течение 5 минут.

Оценке реакции: агглютинация только в первой капле - реакция сомнительная; агглютинация в первой и второй каплях - реакция положительная; агглютинация во всех трех каплях - реакция резко положительная.

Примечание:Реакция Хеддльсона имеет только ориентировочное значение. В случае ее положительного результата необходимо ставить реакцию Райта и аллергическую пробу Бюрне.

Зарисовать реакцию Хеддльсона с указанием доз сыворотки в каждой капле.

§ 6. Реакция Бюрне. Техника постановки реакции:

а) стерильным тампоном, смоченным спиртом, тщательно дезинфицируют кожу на границе верхней и средней трети передней поверхности предпдечъя;

б) в шприц с делениями по 0,1 мл и о тонкой иглой набирают бруцеллин (обратить внимание на внешний вид, данные этикетки и срок годности препарата!) ;

в) держа шприц по возможности параллельно поверхности кожи, вводят иглу внутрикожно. Для этого необходимо держать иглу срезом вверх и толчкообразными движениями насаживать на нее кожу. Когда срез иглы скроется в коже, иглу поворачивают срезом вниз и, осторожно нажимая на поршень, вводят содержимое шприца в кожу (0,1 мл бруцеллина). На месте инъекции должен образоваться небольшой белый волдырь, указывающий на правильное введение препарата;

г) реакцию учитывают дважды: через 24 и 48 часов. В случае положительной реакции (наличие отека и гиперемии) миллиметровой линейкой измеряют размер отека (длина и ширина).

Регистрация чувствительности к антибиотикам выделенной культуры стафилококка.

Антибиотик	Пенициллин	Стрептомицин	Левомицетин	Тетрациклин
Диаметр зоны задержки роста (в миллиметрах)