Лекция 4.1. Явление автотрофии в микробиологии. Бактерии, окисляющие неорганические соединения. Общая характеристика, таксономия, метаболизм, роль в круговороте элементов в биосфере.

План лекции:

1. Явление автотрофии в микробиологии. Характеристика физиологических групп аэробных хемоавтотрофов

2. Нитрофицирующие бактериии.

3. Бактерии, окисляющие серу.

4. Железобактерии.

5. Водородные бактерии.

6. Метаболическая основа хемоавтотрофии.

Явление автотрофии в микробиологии. Характеристика физиологических групп аэробных хемоавтотрофов

Аэробные грамотрицательные бактерии отличаются высокоспециализированной физиологией и представлены двумя группами организмов. Хемоавтотрофы (хемолитотрофы) получают необходимую для их роста энергию за счет окисления неорганических соединений, а метанотрофы получают как энергию, так и углерод за счет окисления метана и других одноуглеродных органических соединений. Несмотря на различия в источниках потребления энергии данные организмы имеют ряд общих черт. В природе все эти бактерии широко распространены в почве и биосфере. Число видов в обеих группах невелико, но как по структуре, так и по физиологии они весьма разнообразны.

По определению хемоавтотрофы могут расти в строго минеральной среде в темноте, образуя углерод клеток из углекислого газа, а АТФ и восстановитель – при окислении органического субстрата в процессе дыхания. Такой способ жизни встречается только у прокариот и характеризуется двумя замечательными свойствами:

1. Высокая специфичность в отношении неорганического источника энергии.

2. Неспособность использовать органические соединения в качестве источников энергии и углерода; более того органические соединения для данных веществ иногда выступают в качестве ингибиторов клеточного роста.

Используемые субстраты

Из неорганических веществ рост хемоавтотрофов способны поддерживать сероводород и другие восстановленные формы серы, аммиак и нитрит, молекулярный водород и закисное железо. Часть этих соединений образуется в результате ме­таболической активности других организмов биосферы, а часть имеет геохимическое происхождение. Следует отметить, что в аэробных условиях некоторые из данных соединений химически неустойчивы. На воздухе H₂S легко окисляется, до элементарной серы, а закисное железо, стабильное в кис­лой среде, самоокисляется в нейтральных и щелочных рас­творах. Химическая неустойчивость H₂S и Fe²⁺ сильно за­трудняет выделение и изучение некоторых организмов, ис­пользующих эти субстраты.

Таблица 1.-Физиологические группы аэробных хемоавтотрофов

Группа	Окисляемый субстрат	Окис­ленный про­дукт	Конечный акцептор электронов	Таксономическая структура
Нитрифи- цирующие бактерии	Окисляющие аммоний Окисляющие ни­трит	NH3   NH2-     H2S, S, S2O3-   Fe2+ H2	NO2-   NO3-     SO42-   Fe3+ Н20	O2   O2     О2, иногда NO3- O2 О2, иногда NO3-	4 рода, 5 видов   3 рода, 3 вида     3 рода, 10 видов2   Несколько родов Вместе с хемо-гетеротрофами делятся на несколько родов; более 10 видов
Бактерии, окисляю­щие серу1 Железобактерии3 Водородные бактерии

1. Один из видов может использовать в качестве источника энергии также и Fe²⁺.

2. Учтены только те представители этой группы, которые выделены в виде чистой культуры; многие описанные в природе окисляющие серу бактерии до сих пор не выделены

3. Ни одна из таких бактерий пока в виде чистой культуры не выделена и их способность расти в хемоавтотрофных условиях не показана.

На основании специфичности хемоавтотрофов в отноше­нии субстратов их можно разделить на четыре основные под­группы (таблица.1). Нитрифицирующие бактерии использу­ют в качестве источника энергии восстановленные неоргани­ческие соединения азота. Представители этой подгруппы обладают очень высокой специфичностью в отношении суб­стратов. Входящие в нее организмы либо окисляют аммоний до нитрита, либо нитрит до нитрата, но ни одна бактерия подгруппы не может окислять оба эти восстановленные сое­динения азота одновременно. Бактерии, окисляющие серу, используют в качестве источника энергии H₂S, элементарную серу или ее частично восстановленные окислы. Все эти ве­щества они превращают в сульфат. Один из представителей данной группы использует в качестве источника энергии так­же и закисное железо. Железобактерии окисляют восстанов­ленное железо или марганец, но не восстановленные соеди­нения серы. Водородные бактерии используют в качестве источника энергии молеку­лярный водород.

НИТРИФИЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ

B середине XIX в. появились косвенные указания на то, что в природе окисление аммония в нитрат осуществляют мик­робы. Однако многочисленные попытки выделить эти аген­ты, пользуясь обычными культуральными средами, оказались безуспешными. Это удалось сделать лишь в 1890 г. С. Виноградскому. Использовав строго неорганические среды, он смог выделить чистые культуры нитрифицирующих бактерий. Было доказано, что за этот процесс отвечают небольшие грамотрицательные палочковидные бактерии — окисляющие аммоний Nitrosomonas и окисляющие нитрит Nitrobacter. Для их роста наиболее благоприятны нейтральные или щелочные условия. Поскольку при окислении аммония до нитрита об­разуется в значительных количествах кислота, среда для вы­ращивания Nitrosomonas должна обладать достаточной бу­ферной емкостью (например, в нее должны быть добавлены нерастворимые карбонаты). Оба типа бактерий растут мед­ленно, и минимальное время их удвоения составляет около 24 ч. Невысок также и выход биомассы в расчете на количе­ство окисленного неорганического субстрата. Виноградский показал, что эти бактерии являются облигатными автотрофами, неспособными развиваться в отсутствие специфичного для них неорганического источника энергии.

Число открытых в последние годы неизвестных ранее бак­терий, окисляющих аммоний и нитрит, весьма невелико. По своей физиологии все они похожи на два упомянутых выше классических прототипа, но удивительно разнородны по структуре (таблица.2). Группа нитрифицирующих бакте­рий невелика и включает всего восемь видов, отнесенных к семи родам, которые различаются по структуре, а также по типу окисляемых субстратов. Вариации в нуклеотидном составе ДНК как среди бактерий, окисляющих аммоний, так и среди бактерий, окисляющих нитрит, невелики, причем у последних ГЦ-содержание существенно выше, чем у первых.

Разнообразию форм клеток нитрифицирующих бактерий соответствует удивительное разнообразие их тонкой струк­туры. У некоторых родов этих бактерий цитоплазматическая мембрана образует обширные, проникающие далеко в глубь клетки везикулярные, ламеллярные или трубчатые разраста­ния, тогда как у других такие разрастания отсутствуют.

Как правило, нитрифицирующие бактерии являются облигатными автотрофами. Исключение составляют некоторые штаммы Nitrobacter, использующие в качестве источника углерода и энергии уксусную кислоту. Однако эти штаммы растут на ацетате гораздо медленнее, чем на нитрате.

ТАБЛИЦА 2.- Нитрофицирующие бактерии

Реакция, пос­тавляющая анергию	Форма клеток	Характер жгутико-вания	Мембран­ные раз­растания	ГЦ-со­держа­ние ДНК, %	Обли-гатная авто-троф-ность	Род
NH3→NO2-	Палочковидные   Туго закру­ченные спи­ральные Сферические   Неправиль­ной формы, дольчатые	Субполяр­ный2 Перитри-хальный2 Перитри-хальный2 Перитри-хальный2	Ламел­лярные Отсутст­вуют Ламел­лярные Везику­лярные	50—51     50—51   54—55	+   +   +   +	Nitrosomo- nas Nitrosospira Nitrosococcus Nitrosolobus
NO2-→NO3-	Палочковидные, часто грушевидные	-	Ламел­лярные	60-62	+ или-	Nitrobacter
Длинные, тонкие па­лочки Сферические	-   Полярный	Отсутст­вуют Трубча­тые		+   +	Nitrospina   Nitrococcus

1. Размножаются почкованием; все остальные нитрифицирующие бактерии размножаются бинарным делением.

2. Некоторые штаммы неподвижны.

Бактерии, ОКИСЛЯЮЩИЕ СЕРУ

При изучении хемоавтотрофии С. Виноградский исследовал свойства хемотрофных нитчатых скользящих бактерий груп­пы Beggiatoa Thiothrix, присутствующих в ряде мест, бога­тых сульфидами и часто содержащих включения элементарной серы. Он показал, что эти организмы могут окислять H₂S, превращая его сначала в элементарную серу, которая и на­капливается в клетках.

Впоследствии отложенная в клетках сера окисляется до сульфата. Позднее было показано, что множество других аэробных бактерий окисляют H₂S аналогичным образом, в результате чего внутри клеток временно откладывается сера. Бесцветные серобактерии составляют очень гетерогенную группу, в которую они объединены по способности окислять восстановленные или частично окисленные неорганические соединения серы. Использование этого свойства в качестве таксономического критерия привело к объединению в одной группе многих таксономически не взаимосвязанных родов. Положение еще более осложнили результаты проведенных за последние несколько лет иссле­дований 5S- и 16S-PHK, показавшие, что виды, классифицированные в пределах некоторых больших родов (например, Thiobacillus), возможно лишь отдаленно родственны между собой, хотя сходны по (эко)физиологии.

Среди бесцветных серобактерий встречаются фактически все известные формы клеток и типы подвижности. Рост представителей этой группы можно обнаружить при значениях рН, покрываю­щих почти весь диапазон — от 1,0 до 10,5. Основ­ные признаки, объединяющие роды «бесцветных серобактерий», — грамотрицателъные, аэробы (не­которые способны к денитрификации), хемолитотрофы. Бактериохлорофилл не содержат. Группа включает облигатных и факультативных хемолитоавтотрофов, а также хемолитогетеротрофов. Некоторые организмы, классифицированные как бесцветные серобактерии (например, виды Beggiatoa), возможно, не истинные хемолитогетеротрофы, поскольку не получают энергию при окислении соединений серы. Они, однако, получают в результате окисления выгоду иными способами. Бесцветные серобактерии могут быть обнаружены везде, где присутствуют восстановленные соедине­ния серы (например, в осадках, в почве, на гра­ницах аэробных и анаэробных зон водоемов и в вулканических источниках, таких как выводные каналы гидротерм). На границе зон сульфид/кис­лород и там, где присутствуют и соединения серы и О₂, можно обнаружить естественное накопление этих бактерий, иногда до 10⁸ клеток на 1 мл и больше. Присутствие бесцветных серобактерий не­редко видно невооруженным глазом — об их рос­те говорит появление обильных белых отложений серы, взвесей, тяжей, розеток или пленок. Пробы, отобранные в освещенных участках, могут также содержать (по крайней мере в местообитаниях с температурой ниже 55°С) фотолитотрофные (пур­пурные) сероокисляющие бактерии, многие из ко­торых способны расти и как хемолитотрофы. Не­обходимо обращать внимание на цвет (красный/ пурпурный, коричневый) осадков или концентри­рованных суспензий бактерий.

Итак, рассмотрим сероокисляющие бактерии, образующие внутриклеточные образования серы. К ним относятся (таблица 3).

ТАБЛИЦА 3.-Бактерии, окисляющие H₂S с образованиемвнутриклеточных отложений серы, не выделенных в виде чистых культур

1. Нитчатые скользящие организмы: Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca

2. Очень крупные одноклеточные скользящие организмы: Achromatium

3. Одноклеточные неподвижные или передвигающиеся с помощью жгути­ков организмы с палочковидными или спиральными клетками:

Клетки палочковидные, неподвижные: Thiobacterium

Клетки палочковидные с полярно расположенными жгутиками: Масromonas.

Круглые или яйцевидные клетки с перитрихальными жгутиками: Thiovulum

Спиральные клетки с полярно расположенными жгутиками: Thiospira

Однако из-за технических трудностей, возникающих при выращивании этих бактерий в аэробных условиях за счет использования H₂S, получить чистую культуру не удалось ни для одного из пе­речисленных в таблице 3 организмов.

Следующую группу серобактерий составляют организмы, у которых внутриклеточные включения серы не видны в световой микроскоп, но клетки могут содержать тонкодисперсную серу. Многие могут осаждать серу в колониях после продолжительной инкубации в присутствии сульфида, что делает колонии (желтовато-) белыми и непрозрачными. характеристика основных представителей данной группы серобактерия представлена в таблице 4.

ТАБЛИЦА 4.- Окисляющие серу хемоавтотрофы, выделенные в виде чистых культур

Признак	Thiobacillus	Thiomicrospira	Sulfolobus
Форма клетки   Расположение жгути­ков ГЦ-содержание ДНК, % Область значений рН, в которых возмо­жен рост Автотрофность	(8 видов) Палочковидная Полярное   34—70   Варьирует     Варьирует	(1 вид) Спиральная Полярное     5,0—8,5     Облигатная	(1 вид) Сферическая, дольчатая Клетки непод­вижны   60—68   0,5—6,0     Факультатив­ная

Большин­ство этих бактерий представляют собой небольшие палочки с полярно расположенными жгутиками; они относятся к роду Thiobacillus и широко распространены как в морской среде, так и на суше. Бактерии с клетками спиральной или вибриоидной формы, Thiomicrospira, встречаются в морском иле, а бактерии с клетками сферической неправильной формы, Sulfolobus, обитают лишь в термальных источниках (таблица 4). Следует отметить, что диапазон значений ГЦ-содержания ДНК организмов этой группы довольно широк, особенно среди тиобацилл. Обшир­ных мембранных разрастаний, которые характерны для многих нитрифицирующих бактерий, нет ни у одной из мелких окисляющих серу бактерий.

Эти организмы хорошо растут в автотрофных условиях, причем если рост происходит за счет тиосульфата, то время генерации составляет всего 2 ч. Общим примечательным свойством организмов этой группы является их толерантность к кислоте. Некоторые виды могут расти при крайне низких значениях рН вплоть до 1 или 2, и неспособны расти при рН выше 6. Эти организмы часто обнаруживаются в специ­фических местообитаниях, где низкое значение рН поддер­живается в результате их собственной метаболической ак­тивности. Термофильная бактерия Sulfolobus встречается в кислых, богатых серой горячих источниках, где сульфид, имеющий геохимическое происхождение, при высокой тем­пературе воды (70-85°С) - на воздухе немедленно превра­щается- в элементарную серу Sulfolobus растет на частицах серы, которая служит для нее окисляемым суб­стратом.

Тиобациллы изобилуют в особых условиях, которые воз­никают в результате деятельности человека. Это, например, откачиваемые из шахт кислые дренажные воды, содержащие минералы сульфидов металлов, в особенности пирит (FeS₂). В таких местах преобладают крайне ацидофильные виды Thiobacillus thiooxidans, которые быстро окисляют элемен­тарную серу, и Т. ferrooxidans, которые могут получать энер­гию как при окислении восстановленных соединений серы, так и при окислении Fe²⁺. Поскольку последний вид способен расти при рН от 2 до 4, когда закисное железо химически устойчиво, можно считать твердо установленным, что этот организм растет в хемоавтотрофных условиях, используя реакцию

Для классических «железобактерий», которые развиваются при более высоких рН (см. нижеследующий материал), этот факт пока нельзя считать доказанным.

Как и в случае нитрифицирующих бактерий, не все окис­ляющие серу бактерии являются облигатными хемоавтотрофами. Sulfolobus,и некоторые тиобациллы способны расти, используя органические источники углерода и энергии, одна­ко субстратом для них могут быть лишь глюкоза и немногие из аминокислот.

Быстрый рост тиобацилл и способность их использовать довольно разнообразные питательные вещества делают эти организмы наиболее удобным объектом при эксперименталь­ном исследовании проблем физиологии хемоавтотрофного способа жизни.

ЖЕЛЕЗОБАКТЕРИИ

В некоторых водоемах с пресной водой содержатся в высо­ких концентрациях восстановленные соли железа. Уже давно известно, что таким местам присуща характер­ная бактериальная флора. Железобактерии образуют природные колонии, покрытые коркой окиси железа. Боль­шинство железистых источников нейтральные или щелочные, и при контакте с воздухом закисное железо быстро спонтан­но окисляется, поэтому доказать его роль в метаболизме этих бактерий было очень трудно. Наиболее типичными предста­вителями железобактерий являются нитчатые, заключенные в чехол бактерии группы Sphaerotilus; у многих из них чехол инкрустирован окисью железа. Их легко выращивать в хемо-гетеротрофных условиях, а значит, и выделять в виде чистой культуры. Показано, что такие чистые культуры накаплива­ют в чехлах окись железа, но его значение для физиологии этих бактерий и их способность развиваться как хемоавтотрофы не доказаны. Более очевидной представляется способ­ность к хемоавтотрофному росту для другой, имеющей ха­рактерную структуру железобактерии, Gallionella. Все по­пытки получить культуры Gallionella в органических средах были безуспешными; в лабораторных условиях ее можно выращивать (хотя и не в виде чистой культуры) на мине­ральной среде, содержащей в качестве минерального источ­ника восстановленного железа осадок сульфида железа. Ис­пользование этой фактически нерастворимой соли железа сводит к минимуму трудности, связанные со спонтанным окис­лением железа при рН около 7,0. В таких культурах Gallionella образует на стенках сосуда хлопьевидные колонии. Они состоят в основном из неорганического материала, а маленькие бобовидные клетки этой бактерии располагаются на раз­ветвленных кончиках пропитанных гидроокисью железа сте­бельков.

ВОДОРОДНЫЕ БАКТЕРИИ

Многие виды аэробных бактерий способны расти в хемоавтотрофных условиях в присутствии молекулярного водорода. В отличие от других групп хемоавтотрофов все водородные бактерии могут использовать самые разные питательные ве­щества, а в качестве источников углерода и энергии — широ­кий спектр органических соединений. Водородные бактерии делят на несколько родов, которые включают также сходные по фенотипу неавтотрофные бактерии (таблица 6). Некоторые водородные бактерии явно близки к неавтотрофным видам. Например, во­дородная бактерия Pseudomonas facilis фенотипически очень похожа на неавтотрофную бактерию P. delafieldii и, исходя из результатов опытов по гибридизации ДНК in vitro, гене­тически весьма близка к этому виду.

ТАБЛИЦА 6.- Распределение факультотивно хемоавтотрофных водородных бактерий по родам

Форма клеток	Окрас­ка по Граму	Прикрепление жгутиков	ГЦ-со-держа-ние ДНК, %	Род	Виды, окисляющие Н2
Палочки	-	Полярное	61 - 72	Pseudomo­nas

P. saccharophila

P. facilis P. ruhlandii
Палочки	-	Перитрихаль-ное	67 - 68	Alcaligenes	A. eutrophus A. paradoxus
Кокки	-	-		Paracoccus	P. denitrificans
Разветвлен­ные палочки	+	-	65 - 70	Nocardia	N. opaca