Прикладная инфекционная иммунология

Серологические реакции – это реакции взаимодействия между антигенами и специфическими антителами in vitro, имеющие различные видимые проявления. Различают две фазы: 1 - специфическая невидимая – происходит в результате взаимодействия находящихся на поверхности антигена эпитопов с активными центрами специфических антител-иммуноглобулинов, сформировавшихся под влиянием этого антигена; 2 - неспецифическая видимая фаза – происходит при участии дополнительных факторов (электролит, комплемент). Эти реакции используют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, с целью определения серогруппы, вида, серовара выделенного микроба (серологическая идентификация), для обнаружения антител в сыворотке больного (серодиагностика).

Р-ция агглютинации – склеивание микробов или других клеток с образованием конгломератов (хлопья) под действием специфических антител (агглютининов) в присутствии электролита. Ингредиенты: испытуемая культура на скошенном МПА, диагностирующая агглютининовая сыв-ка, физ. р-р. На предметное стекло каплю диагностической сыворотки, рядом каплю физ. р-ра (контроль), испытуемую культуру сначала в физ. р-р, а затем в диагностическую сыворотку, склеивание происходит в течение первых минут. При поркачивании стекла в каплю с диагностической сывороткой – хлопья, а жидкость прозрачная. Контрольная капля – мутная. Эту реакцию ставят как с целью идентификации выделеной от больного чистой культуры м/о, так и для серодиагностики (определение антител в сыворотке больного). Развернутая РА. Ингредиенты: сыв-ка больного, диагностикум (взвесь известных убитых микробов), физ. р-р. В штативе 7 пробирок, в 7-ю 2,4 мл физ. р-ра , в остальных - 1,0 мл. Готовят двукратное возрастающее разведение сыворотки (от 1:50 до 1:800). 6-я пробирка контроль антигена (содержит физ. р-р), 7-я контроль сыворотки (содержит сыв-ку в разведении 1:25). В 6-ть пробирок добавляют по 3 капли диагностикума, затем на 2 часа в термостат при +37 град.С, на следующий день определяют типы сыворотки. Положит. Рез-т – образуются хлопья, жидкость светлеет, хлопья выпадают в осадок, жидкость над ними прозрачная. В контроле антигена и в разведенной испытуемой сыворотке содержимое пробирок равномерно мутное, в контроле сыворотке содержимое прозрачное. Титр сыворотки – это то наибольшее разведение сыворотки, где еще наблюдается агглютинация. Характер и скорость р-ции зависят от антигенного строения бактериальной клетки: мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков, протекает медленно; при наличии Н-антигена р-ция проявляется в образовании крупно-хлопьевидного осадка, протекает быстрее.

Р-ция адсорбции по Кастеллани: основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки групповые АТ при сохранении в ней типа специфических АТ, полученные сыв-ки называются монорецепторные – содержат АТ только к одному определенному АГ. Используются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара.

РНГА – основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности растворенные антигены и гаптены бактерии, вирусов, др. микробов и их токсины. При этом эритроциты приобретают серологическую специфичность сорбированных антигенов и вместе с ней способность агглютинироваться сыворотками, содержащими антитела против этих антигенов. Ингредиенты: эритроцитарные антигенные диагностикумы, исследуемая сыв-ка (сыв-ка больного). Рез-ты: + - осадок эритроцитов в лунке имеют форму зонтика, «-» - эритроциты оседают в центре дна лунки в виде пуговки.

Другие диагностикумы: РНГА ставят также с антительными эритроцитарными диагностикумами, а этом случае на эритроцитах сорбированы Ig (т.е. известные антитела), а определяют неизвестные антигены – возбудители бак. или вирусных инфекций, а также токсины. Эта р-ция называется РОНГА. Существуют различные варианты р-ции непрямой (пассивной) агглютинации, в которых для сорбции антигенов или антител используют не эритроциты, а разл. инертные носители - частицы латокса, целлюлозы и др.

РОНГА – ставят эритроцитарным антительным диагностикумом, который состоит из взвеси отмытых эритроцитов, нагруженных специфическими Ig. С пом. этой р-ции можно быстро обнаружить дифтерийный токсин в исследуемом материале. Рез-ты: зонтик-пуговка.

РНАТ – разновидность РНГА и позволяет быстро выявить неизвесный антиген. Ингредиенты: культуральная жидкость, возможно содержащая дифтерийный токсин; противадифтерийная антитоксическая сыв-ка (известные антитела); эритр. антиг. диагностикум, нагруженный дифтерийным токсином. Рез-ты: зонтик-пуговка.

РТГА – явл-ся вариантом р-ции нейтрализации вируса. Основана на способности противовирусной антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию эритроцитов определенных видов животных. Объясняется способностью специфических антисывороток нейтрализовать вирусные гемагглютинины. Широко применяется для идентификации и типирования вирусов, а также для выявления антигемагглютининов в сыв-ке крови исследуемых людей.

Р-ция латекс-агглютинации – носителем АТ в этой диагностической системе явл-ся мелкие стандартные частички латекса. Специфичность lac контролируют с помощью 3-х контрольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах: заведомо «+» р-ция, заведомо «-» р-ция и контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ-несенсибилизированным (не несущим АТ) латексам с исследуемым мат-лом. Используют для быстрого обнаружения м/о или их АГ в исследуемом мат-ле.

Р-ция коагглютинации – явл-ся одним из вариантов пассивной, т.е. опосредованной клетками-носителями АТ, укоренной р-ции агглютинации на стекле. Сущность р-ции основывается на св-ве золотистого стафилококка (имеет в составе КС белок А) связываться с Fc-фрагментами IgG и IgM. При этом активные центры АТ остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами АГ.

Р-ция преципитации – это осаждение преципитиногена (мелкодисперсные антигены) специфическими антителами преципитинами в присутствии электролитов. Выпадение растворимого комплекса «антиген+антитело» наблюдается при эквивалентных соотношениях ингредиентов. Ингредиенты: антитела – испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка, антиген – экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих м/о. Способы постановки – преципитация в жидкой среде (р-ции флоккуляции, р-ции кольцепреципитации) и преципитация в геле.

Р-ция кольцепреципитации: в узкие пробирки наливают одно и тоже разведение сыворотки, а затем осторожно пастеровской пипеткой наслаивают исследуемый преципитиноген, учет через 1-2 мин. Контроль с нормальной сывороткой, на которою наслаивают преципитиноген. При «+» р-ции на границе между сывороткой и преципитиногеном появляется преципитат в виде белого кольца, в контроле он отсутствует. Титр р-ции является то наиб. разведение преципитиногена, в котором еще образуется это кольцо.

Преципитация по Оухтерлони. Принцип метода состоит в том, что антиген и антитело, реагируя в геле образует преципитат в виде линии белого цвета. В чашке Петри наливают просветвленный агар и в нем делают несколько лунок на равном расстоянии др. от друга (одна в центре, остальные вокруг нее). В центральные антитела, в лунки по периферии испытуемые антигены. + р-ция – образуются линии преципитации между лунками сыворотки и преципитиногеном.

Р-ция флокулляции наблюдается при соединении экзотоксина (или анатоксина) специфической антитоксической сыв-кой в присутствии электролита, при этом выпадают мелкие хлопья флокуллята. Образование хлопьев быстрее происходит в пробирке с нейтральной смесью, где кол-во антитоксина соответствует кол-ву токсина, т.е. происходит так называемая «инициальная» флокулляция, после наступления которой и учитывают р-цию. Применяется для титрования антитоксических сыв-к, токсинов и анатоксинов, а также для определения типа токсина.

Радиальная диффузия по Манчини. Метод основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыв-ки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого Ig. Содержание Ig определяют относительно стандартной сыв-ки крови чел-ка с известной концентрацией IgM, IgG или IgA.

Иммунноэлектрофорез - это метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлони на одной и той же пластинке агарового геля. Метод: 1 этап – исследуемое в-во разделяют при помощи электрофореза в геле на составные компонент с различной электрофоретической подвижностью; 2 этап – проводят р-ции преципитации в геле. Антитела и разделенные электрофорезом антигенные компоненты диффундируют в геле на встречу друг другу и образуют дуги преципитации различной кривизны и расположения.

Сходство и различия р-ции агглютинации и преципитации. Различия между ними зависит главным образом от величины частиц антигена. Преципитация – это когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, то это агглютинация.

Р-ции иммунного лизиса– это растворение жизнеспособных клеток (корпускулярных антигенов), соединенных со специфическими антителами в присутствии комплемента. Это приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Разновидности: р-ция гемолиза и р-ция бактериолиза.

Р-ция бактериолиза – это расстворение бактерий в присутствии специфических антител – бактериолизинов и комплемента. Ингредиенты: живые бактерии, специфические по отношению к ним антитела (иммунная сыворотка или иммунизированное животное), комплемент. Применение: как защитная р-ция бактериолиз наиболее выражен при холере, сальмонеллезных инфекциях. Постановка: в пробирку вносят взвесь живых бактерий, специфическую иммунную сыворотку и комплемент, в контрольную пробирку – те же бактерии, сыворотку без антител и комплемент; на 2 часа в термостат при 37 град. С. Затем из каждой пробирки делают высевы по 0,1 мл на чашки Петри с МПА. Учет опыта: на чашке с высевом из опытной пробирки колоний значительно меньше, чем в контроле.

Р-ция иммунного гемолиза – это растворение эритроцитов в присутствии специфических антител – гемолизинов и комплемента. Р-ция иммунного гемолиза уч-ет в р-ции связывания комплемента в качестве индикаторной системы. Ингредиенты: эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент. Постановка: берут 5 пробирок – первая из которых является опытом, остальные 4-е контроля, добавляют ингредиенты, в том числе и эритроциты собаки (для контроля специфичности антигена), инкубация при 37 град. С в течении 30 мин. Учет: + - гемолиз (жидкость ярко-розового цвета); «-» - отсутствие гемолиза (жидкость бесцветная, на дне осадок эритроцитов.

РСК- основана на способности комплемента абсорбироваться на любом комплексе антиген+антитело. Уч-ет две системы: основная и индикаторная, а также комплемент. 1. (основная система) – состоит из определяемого антитела и известного антигена, к ним добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют др. др., то образуется комплекс антиген+антитело к которому присоединяется комплемент (процесс связывания комплемента невидимый). Чтобы выявить наличие или отсутствие связывания комплемента и тем самым подтвердить соответствие антигена и антитела в первой системе или их несоответствие в РСК уч-ет 2 (индикаторная система) – антиген-антитело: эритроциты барана+гемолитическая сыв-ка. Если есть комплекс антиген+антитело, то при добавлении индикаторной системы гемолиза не произойдет, если же нет соответствия между определяемым и известным антителом гемолиз эритроцитов будет. Ингредиенты РСК – исследуемая сыв-ка, комплемент, известный антиген (корпускулярный или растворимый), эритроциты барана, гемолитическая сыв-ка, физ. р-р. Подготовительная работа перед постановкой основного опыта РСК заключается в титровании, т.к. при постановке РСК необходимо соблюдение точных количественных соотношений между ингредиентами р-ций. Титр комплемента– это содержимое пробирки с наименьшим количеством комплемента, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов в присутствии гемолитической сыв-ки. В основной опыт РСК берут рабочую дозу комплемента (должна превышать его титр на 20-30 %). Схема постановки РСК. Производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыв-ки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37 град. С в течении 1 часа. Если в сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном и комплексом антиген+антитело свяжут добавленный комплемент; если же в сыворотке антитела отсутствуют, комплекс антиген+антитело не образуется и комплемент останется свободным. Учет р-ции: + + + + резко положительная р-ция – полная задержка гемолиза (эритроциты оседают на дно пробирки, жидкость над осадком бесцветная); + + + и + + положительная р-ция – неполная задержка гемолиза (имеется осадок эритроцитов, жидкость окрашена в розовый цвет, при + + жидкость более розового цвета, чем при + + +); + слабо положительная р-ция (неполный гемолиз: незначительный осадок эритроцитов, жидкость окрашена в розовый цвет); «-» отрицательная р-ция - полный гемолиз (жидкость ярко-розового цвета – лаковая кровь, осадок отсутствует). Цель применения РСК – РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и широко используется в серодиагностике инфекционных заболеваний как для определения антител, так и антигенов в исследуемых материалах от больных.

Р-ции нейтрализации токсина антитоксином. Эта р-ция заключается во взаимодействии м-у экзотоксином (антиген) и специфической антитоксической сыв-кой (антитело-антитоксин), в рез-те чего образуется комплекс антиген+антитело и экзотоксин теряет свои токсические св-ва. В качестве антигена в р-ции может уч-ть и анатоксин, второй ингредиент р-ции – антитоксическая сыв-ка, содерж. антитела-антитоксины. Р-цию ставят «ин виво» и «ин витро». Применяют с диагностическими целями, осущ-ют титрование токсинов, анатоксина и антитоксина (для определения степени их активности). Для проведения р-ции ин виво – исслед. материал смешивают со специфической антитоксической сыв-кой, выдрж. в термостате, затем вводят лабораторным животным: если произошла р-ция нейтрализации (при соответствии экзо- и анатоксина), то жив. останутся живыми. Контрольным животным вводят тот же исследуемый материал без антитоксической сыв-ки, они должны погибнуть от д-я экзотоксина. Такие пробы ставят при лаб. Диагностики столбняка, ботуллизма, анаэробной раневой газовой инф-ии и др. Р-ции ин витро (р-ция нейтрализации в геле): р-ции флоккуляции, р-ция нейтрализации в геле по Оухтерлони, РОНГА, РНАТ.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции) –этом-д выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-д-ки инфекц. заболеваний (идентификация возбудителя в иссл. материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Иммунофлюоресцентнй метод дает возможность сочетать морфологические исследования с серологическими и быстро (за 1-2 часа) обнаружить и идентифицировать различные микробные антигены, особенно в зараженных клетках и тканях. Возможно применение этого метода и для обнаружения антител. Прямой И. м. состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной к-ры с-кой, содержащей специфические Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и рассматривают в люминесцентный микроскоп. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. При непрямом. И. м.на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующей специфической с-кой, на втором - люминесцирующей с-кой против -глобулинов того животного, с-ка к-рого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод). Кроме люминесцентного микроскопа для учета РИФ при фенотипировании клеток применяют лазерный сортировщик клеток.

Иммуноферментный метод -определение Аг или Ат с помощью Ат или Аг, ковалентно соединенных с ферментом. Образующийся иммунный комплекс выявляют с помощью фотометрического измерения оптической плотности окрашенных продуктов, к-рые образуются в результате ферментативного расщепления субстрата ферментом. В настоящее время И. м. применяется для серол. д-ки инфекц. болезней (СПИДа, вирусных гепатитов, хламидиоза, токсоплазмоза и др.), определения содержания гормонов, компонентов комплемента, IgE (общего и специфического) и др. Для м-да характерна высокая специфичность и чувствительность; высокий уровень автоматизации создается благодаря наличию специальных анализаторов и стандартных тест-систем. Различают прямой способ, когда ферментом метят специфические Ig (Ат), и непрямой, при к-ром иммунный комплекс выявляют мечеными антииммуноглобулинами.

Иммуноблотинг. В основе иммуноблотинга лежит идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченных антивидовых антител. С помощью этого метода можно определить индивидуальные антитела к отдельным макромолекулам, для серологической диагностике ВИЧ-инфекции.

Диагностические сыворотки подразделяются на: люминисцирующие (для прямого и непрямого метода, содержит АТ с пришитой флюоресцентной меткой), гемолитические (содержит АТ против эритроцита барана, используется для приготовления РСК), агглютинирующие (адсорбированные и неадсорбированные), преципитирующие (менингококковая, сибиреязвенная), антитоксические (содержат АТ против определенных токсинов – дифтерийная, столбнячная. Ботулиническая) и др. в зависимости от серологической р-ции, в которой они принимают участие. Адсорбированные диагн. сыв-ки – это хорошо очищенные сыв-ки, служат для избежания групповой агглютинации; титры низкие, строго специфичны; их применяют в р-ции агглютинации на стекле. Неадсорбированные сыв-ки (видовые) – обладают высоким титром, но недостаточно специфичны; они содержат несколько антител соответственно набору антигенов у бак. кл., которыми проводилась иммунизация; эта сыворотка может содержать групповые антитела, за счет которых она будет давать агглютинацию не только с гомологичными бактериями, но и с гетерологичными родственными бактериями. Групповая агглютинация часто встречается у представителей рода сальмонелл (S. typhi, S. paratyphi). Их применяют как в р-ции агглютинации на стекле, так и при постановке развернутой р-ции агглютинации в пробирках. Способ получения адсорбированных монорецепторных агглютинирующих сыв-к. К видовой иммунной сыворотке добавляют густую взвесь гетерологичных родственных бактерий, содерж. такие групповые антигены, антитела против которых требуется извлечь из сыворотки. После выдерживания в термостате сыв-ку центрифугируют, в рез-те чего образовавшиеся комплексы между групповыми антигенами и антителами оказываются в осадке и удаляются, а в жидкой части сыворотки остаются специфические антитела (к рецепторам обычно одной специфичности). Эти сыворотки получают из нативных видовых сыв-к, пользуясь методом адсорбции антител по Кастеллани, во избежании групповой агглютинации. Адсорбированные сыв-ки хар-ся строгой специфичностью, их титры обычно низкие.

Моноклональные антитела – этоструктурно и функционально гомогенные Ig, синтезируемые одним клоном плазмоцитов. Обнаруживаются в сыв-ке крови б-ных миеломой, макроглобулинемией Вальденстрема м-дом электрофореза. С помощью гибридомной технологииполучают моноклональные антитела, к-рые используют для приготовления диагностических систем, применяемых для иммунофлюоресцент-ного, иммуноферментного, радиоиммунного и др. м-дов. Моноклональные антитела используют в диагностике многих бактериальных, вирусных инф-ий и др. В настоящее время разрабатываются методы применения моноклональных антител для иммунотерапии и иммунопрофилактики. Моноклональные антитела получают с пом. спец. гибридомной технологии, позволяющей нарабатывать их в неограниченном кол-ве. Проводят слияние В-клеток и миеломных клеток, воздействуя полиэтиленгликолем, и получают гибридные клетки – гибридомы, обладающие св-ми обеих родительских клеток: способностью к антителообразованию и к непрерывному делению. Клетки-гибридомы культивируют в спец. среде (где не могут размножаться исходные, не гибридные клетки) и производят клонирование, то есть получают различные клоны клеток путем размножения из одной исходной гибридомной антителообразующейся клетки. Моноклональные антитела однородны по своему составу и способны связываться только с одной детерминантой (эпитопом) антигена – это и является их преимуществом.

Диагностикумы –это набор известных стандартных корпускулярных или растворимых антигенов при постановке серологических р-ций, необходимых для установления присутствия антитела в исследуемых сыворотках. Их подразделяют: 1) монодиагностикумы (имеются антигенные детерминанты одной специфичности) – сальмонеллезные Н-диагностикумы: а, b, c, d и др.; 2) с полным набором антигенов микробной клетки и содерж. некоторые антигены (О-, Vi-, Н- брюшнотифозные диагностикумы); 3) корпускулярные диагностикумы (из штаммов микробов с типичными св-ми, инактивированных нагреванием или воздействием хим-их в-в); 4) эритроцитарные антигенные диагностикумы (из формализированных эритроцитов с сорбированными на них растворенными антигенами различных микробов); 5) антительные эритроцитарные диагностикумы (с сорбированными на эритроцитах Ig). Диагностикумы уч-ют в р-циях агглютинации, непрямой гемагглютинации, р-ции нейтрализации, р-ции связывания комплемента и иммуноферментном анализе, с пом. которых выявляют специфические антитела в исследуемых сыворотках людей и животных.

Аллергены -м.б. чужеродные вещества (экзоаллергены), собственные ткани и молекулы организма (аутоаллергены) или вещества, состоящие из чужеродных соединений гаптенной природы и собственных белков (комплексные аллергены). В зависимости от природы экзоаллергены разделяют на инфекционные и неинфекционные. В диагностических целях аллергены вводят накожно или внутрикожно. В естественных условиях аллергены проникают в организм через дыхательные пути (ингаляционные аллергены), вместе с пищей (алиментарные аллергены), при контакте с кожей или слизистыми оболочками (контактные аллергены), при укусе кровососущих насекомых и парентеральном введении лекарств (парентеральные аллергены).