Правила, используемые при интерпретации спектров ЯМР

1. Величина химического сдвига протонов определенной химической группы (например, метальной, этильной, окси-группы) меняется в зависимости от молекулы, частью которой является эта группа (например, определенной ами­нокислоты или нуклеотида).

2. Если соединение, протон которого имеет данный химический сдвиг, является мономерным звеном полимера, химический сдвиг, как правило, меня­ется вследствие близости остатков других молекул или групп.

а. Наибольшие сдвиги (20—30 м. д.) вызывает присутствие неспаренных электронов (т. е. парамагнитных центров).

б. Сдвиги, равные приблизительно 2 м. д., обычно наблюдаются в резуль­тате влияния кольцевых токов. Величина сдвига, обусловленного кольце­выми токами, меняется приблизительно в следующем порядке: флавины и порфирины > триптофан и нуклеотиды > гистидин > тирозин и фе­нила ланин.

в. Электрические поля многих заряженных групп, например, в аспарагиновой и глутаминовой кислотах, лизине, аргинине и гистидине вызывают смещение сигналов. Сдвиг мал, если группа находится на внешней части свернутой макромолекулы и, следовательно, взаимодействует, в первую очередь, с растворителем; он увеличивается, если группа находится вну­три.

3. Если в результате химического или физического воздействия на макро­молекулу меняется химический сдвиг определенного протона, это значит, что произошло изменение в структуре макромолекулы в участке, окружающем про­тон. Если это воздействие включает изменение рН, то сдвиг скорее происхо­дит от изменения состояния ионизации, чем от изменения пространственной структуры.

4. Наличие расщепления показывает, что две группы ядер ковалентно свя­заны друг с другом. По числу линий в мультиплете можно иногда установить, какая это могла быть группа. Например, квартет часто означает, что поблизо­сти находится метильная группа. Разделение компонентов мультиплета связано с углом между группами, содержащими ядра. Иногда путем сравнения с сое­динениями, структура которых известна из данных рентгеноструктурного ана­лиза, могут быть определены углы между связями в небольших простых моле­кулах. В случае макромолекул действие любого агента, приводящее к измене­нию углов между связями, должно приводить к изменению расстояния между компонентами мультиплета. Это указывает на то, какого рода конформационные перестройки могут иметь место.

5. В случае многокомпонентной системы, в которой быстро происходит са­моассоциация (например, димеризация), величина химического сдвига, ширина линии и число линий определяются относительным количеством вре­мени, проведенным протоном в каждом состоянии. В такой системе смещение равновесия или изменение скорости обмена может приводить к изменению ши­рины отдельной линии или вызвать разделение сигнала на отдельные сигналы. Изменения такого типа можно использовать для изучения равновесия.

6. Ширина линии есть мера относительной подвижности ядра. Если ядро движется очень быстро, как это бывает в малой молекуле, пики очень узкие. Если ядро движется более медленно, как в жесткой (фиксированной третичной структурой) части макромолекулы,.линии становятся шире. Ширину линии мож­но использовать для оценки подвижности функциональной группы или мономер­ного остатка в полимере при условии, что изменение ширины полосы не выз­вано причинами, указанными в правиле 5, и не связано с изменением положе­ния очень близкой неразрешенной и неотнесенной линии.

7. Связывание лиганда с участком макромолекулы обычно оказывает влия­ние как на спектр лиганда, так и на спектр макромолекулы. Хотя такие фак­торы, как перераспределение локального заряда, изменения в ориентации групп, находящихся на расстоянии от места связывания, и т. д. могут приво­дить к спектральным изменениям, во многих случаях их причиной являются ядра, расположенные в месте связывания. Обычно наблюдается смещение линии, сопровождаемое ее уширением, так как в участке связывания, вероятно, пони­жается свобода движения ядер.

Литература

· Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – «Мир»:М., 1980

ЗАНЯТИЕ № 13

ТЕМА: Итоговое занятие: Физические методы исследования биомакромолекул

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Поглощение света. Закон Бугера-Ламберта-Бэра. Молярный коэффициент поглощения.

2. Спектры поглощения биомолекул в видимой и ультрафиолетовой области спектра. Спектры поглощения аминокислот и нуклеотидов.

3. Гипохромный и гиперхромный эффекты в спектрах поглощения белков и нуклеиновых кислот.

4. Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера. Влияние мутности раствора.

5. Способы регистрации молекулярных спектров поглощения. Устройство одно- и двулучевых спектрофотометров.

6. Энергия возбужденного состояния. Пути растраты энергии. Синглетное и триплетное состояние. Интеркомбинационная конверсия. Время жизни возбужденного состояния. Времена жизни синглетных и триплетных состояний.

7. Квантовый выход флуоресценции. Факторы, определяющие интенсивность флуоресценции. Внутреннее и внешнее экранирование.

8. Температурная зависимость квантового выхода флуоресценции. Эффект Шпольского.

9. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции. Стоксов сдвиг при флуоресценции и фосфоресценции.

10. Тушение флуоресценции. Уравнение Штерна-Фольмера.

11. Флуоресценция субстратов и коферментов.

12. Собственная флуоресценция аминокислот. Зависимость характеристик спектров испускания от окружения.

13. Собственная флуоресценция белков. Зависимость характеристик флуоресценции от состояния белка.

14. Флуоресцентные зонды и метки. Основные принципы их использования при изучении свойств биомакромолекул.

15. Поляризация флуоресценции. Формула Яблонского-Перрена.

16. Способы регистрации спектров флуоресценции. Функциональная схема спектрофлуориметра.

17. Перенос электрона в двухуровневой системе. Обратимость процесса. Условия обеспечения необратимости процесса переноса электрона.

18. Туннелирование электронов и ядер. Электронно-колебательные взаимодействия при туннелировании электрона.

19. Индуктивно-резонансный перенос энергии электронного возбуждения. Механизм Фёрстера. Расстояния переноса. «Флуоресцентная линейка».

20. Обменно-резонансный перенос энергии. Возможность переноса в системах триплет-триплет, синглет-синглет, синглет-триплет. Расстояния переноса.

21. Экситонный механизм миграции энергии.

22. Перенос электрона в процессе фотосинтеза.

23. Принцип метода ЭПР. Механический и магнитный моменты электрона. Магнетон Бора.

24. Эффект Зеемана. Основное уравнение резонанса. G-фактор.

25. Характеристики спектров ЭПР: амплитуда, форма линии, ширина линии.

26. Времена продольной и поперечной релаксации (T₁, T₂).

27. Расщепление линий. Сверхтонкая структура спектров ЭПР.

28. Устройство радиоспектрометра ЭПР.

29. Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях. Метод спиновых меток и зондов. Метод спиновых ловушек.

30. Спины ядер. Ядра с получисленным спином. Ларморова прецессия. Основное уравнение резонанса.

31. ЯМР: химический сдвиг, расщепление линий.

32. ЯМР: спин-спиновая и спин-решеточная релаксация.

33. Использование ЯМР в исследовании структуры и функции биомакромолекул.

Задачи