Задание к лабораторной работе
8.2.1 Приготовить микропрепараты из подготовленных различными способами проб молока.
Методика выполнения работы.
Молоко необходимо разлить в колбы объёмом 100 мл приблизительно по 40-50 мл, закрыть их ватными пробками. Параллельно осуществляют второй вариант опыта. Разлив молоко в колбы, закрывают их ватными пробками, доводят молоко до кипения. Колбы с кипяченым и некипячёным молоком ставят в термостат при температуре 30 0С.
Через 10-12 ч свежее (некипяченое) молоко скисает. В колбе образуется плотный, ровный сгусток без следов газа. Сгусток образуется вследствие того, что молочная кислота реагирует с казеинатом кальция и кальций выпадает в осадок.
В кипячёном молоке молочно-кислые бактерии, поскольку они не образуют спор, погибают, споры же масляно-кислых бактерий сохраняются. При инкубации в термостате они прорастают, осуществляя масляно-кислое брожение лактозы. В результате реакции масляной кислоты с казеинатом кальция в этом варианте в осадок выпадает казеиновая кислота. В дальнейшем она подвергается пептонизации; осадок переходит в кремовую жидкость с неприятным запахом масляной кислоты (запах пота) и прогорклым вкусом.
1 Из прокисшего молока готовят микропрепарат. Бактериологической петлёй извлекают сгусток, размазывают его на предметном стекле очень тонким слоем без воды.
2 Сушат на воздухе
3 Фиксируют смесью спирта с эфиром (примерно 1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая её. При такой фиксации бактерии не только погибают и прикрепляются к стеклу, но и, параллельно, эфиром извлекается и удаляется жир. Это необходимо, поскольку капли жира на препарате мешают окраске и микроскопированию.
4 Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим в течение 2-3 мин
5 Промывают водой
6 Высушивают и микроскопируют с иммерсией.
Метиленовый синий – лучший краситель для молочно-кислых бактерий, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо окрашивает клетки бактерий. Получаются наиболее четкие препараты.
8.2.2 Полученные результаты зарисовать, сделать выводы.
В микропрепарате чаще преобладают мелкие округлые клетки Streptococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Этот микроорганизм является возбудителем естественным скисанием молока в наших широтах. Оптимальная температура его развития – 30 0С. Он накапливает до 1 % молочной кислоты.
Нередко в препарате наблюдаются тонкие палочки рода Lactobacterium, варьирующие в размере, иногда содержащие зерна волютина. Чаще встречается Lactobacterium bugaricum – возбудитель естественного скисания молока в южных широтах. Оптимальная температура его развития – 40 0С. Кислотоустойчив, он накапливает до 3,5 % молочной кислоты.
Если на поверхности скисшего молока появляется плёнка, то в мазке обнаруживается так же и молочная плесень, четырехугольные или овальные клетки которой отличаются от молочно-кислых своими размерами.
8.2.3 Скисшие образцы проверить на наличие молочной кислоты.
Наличие молочной кислоты в скисших образцах можно подтвердить качественными реакциями.
Методика выполнения работы.
В коническую колбу объёмом 100 мл берут 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл крепкой серной кислоты, и нагревают при взбалтывании до начала кипения. Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5 мл 5 % р-ра КМnО4, который обесцвечивается. В этих условиях молочная кислота переходит в уксусный альдегид.
Для распознавания уксусного альдегида быстро покрывают горлышко колбы фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором АgNО3. Аккуратно, чтобы не разорвать фильтровальную бумагу, прижимают её к краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, реагируя с аммиачным раствором АgNО3, вызывает почернение бумаги с серебристой побежалостью. Так выделяется металлическое серебро.
8.2.4 Учесть результаты реакции и занести в таблицу (таблица 3).
Таблица 3 - Протокол исследования
| Название опыта | Молоко некипячёное | Молоко кипячёное |
| Микроскопия | ||
| Реакция на молочную кислоту |
Вопросы к защите лабораторной работы
1 На какие виды в зависимости от соотношения получаемых конечных продуктов подразделяется молочно-кислое брожение?
2 Что является продуктом брожения гомоферментативных молочно-кислых бактерий
3 Какой продукт образуется в результате брожения гетероферментативных молочно-кислых бактерий?
4 Охарактеризуйте молочно-кислые бактерии.
5 Какими по морфологии могут быть молочно-кислые бактерии?
6 Какой антибиотик вырабатывается некоторыми молочно-кислыми бактериями?
Лабораторная работа № 8. Определение бактериальной обсемененности пищевых продуктов
Цель работы – познакомиться с лабораторными методами исследования пищевых продуктов.
Ход работы
В соответствии со стандартом свежесть мяса убойных животных, субпродуктов, птицы определяют по органолептическим показателям: внешнему виду и цвету поверхности туши и мышц на разрезе, консистенции, запаху, состоянию жира, сухожилий, прозрачности и аромату бульона. Мясо сомнительной свежести хотя бы по одному из этих показателей подвергают химическому и бактериологическому анализу.
Бактериоскопический метод подсчета (метод отпечатков) применяется для оценки свежести мяса, однако может быть использован и для ориентировочной оценки количественного и качественного состава микрофлоры других продуктов – рыбы и полуфабрикатов. Для микроскопического исследования из проб мяса готовят не меньше трех мазков-отпечатков: один с поверхностного слоя с глубины 1-2 см, другой с глубины 2-2,5 см и третий – с глубины 3-3,5 см.
Для приготовления препарата-отпечатка с поверхностного слоя мяса стерильными ножницами вырезают кусочек 0,5-1 г и срезанной стороной делают тонкие отпечатки на слегка подогретом предметном стекле. Чтобы приготовить препарат-отпечаток из глубоких слоёв, поверхность мяса сначала прижигают нагретым шпателем, а затем стерильным скальпелем производят глубокий разрез, пинцетом раздвигают края, вырезают кусочек мяса и, прикладывая его к поверхности предметного стекла, делают отпечатки.
Приготовленные мазки подсушивают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Просматривают не менее 5 полей зрения. В каждом поле подсчитывают отдельно кокковые и палочковидные микробы, затем вычисляют их средне арифметическое количество в одном поле зрения. Свежесть мяса определяют по справочной таблице 4.
При микроскопическом анализе кисломолочных продуктов обязательно обращают внимание на видовой состав микрофлоры продукта. Различные кисломолочные продукты характеризуются свойственной им микрофлорой, так как для приготовления обыкновенной простокваши, кефира, сметаны и творогаиспользуются закваски, состоящие из чистых культур Str. lactis, Str. cremoris, Str. diacetilactis и др.
Таблица 4 – Оценка свежести мяса микроскопическим методом
| Степень свежести мяса | рН | Характеристика отпечатков |
| Свежее | 5,9-5,5 | Микрофлора не обнаруживается или видны единичные экземпляры кокков, дрожжей, палочек в поле зрения препарата. Отсутствуют остатки разложившейся ткани мяса. Окраска микрофлоры грамположительная. |
| Сомнительной свежести | 6,5 | На отпечатках 20-30 кокков или несколько палочек в поле зрения микроскопа. Ясно видны следы распада мышечной ткани. Окраска микрофлоры грамотрицательная. |
| Несвежее | 6,7 | В поле зрения много микроорганизмов, преобладают грамотрицательные палочки (почти все поле зрения усеяно ими). Много распавшейся ткани мышц. |
Поэтому, чтобы сделать вывод о свежести кисломолочных продуктов, необходимо хорошо знать микрофлору закваски и как она выглядит под микроскопом.
Из продукта приготавливают окрашенные комбинированным фиксатором препараты (комбинированный фиксатор: 1 часть метилового спирта, 1 часть эфира, 0,2 части метиленового синего). При микроскопировании определяют морфологию и количественное соотношение молочнокислых микробов закваски. Регистрирует постороннюю микрофлору, которая определяет загрязненность продукта (дрожжи, бациллы, мицелий и др.). для определения свежести продукта используйте справочную таблицу 5.
Таблица 5 – Микрофлора кисломолочных продуктов
| Наименование продукта | Микрофлора закваски |
| Простокваша, ряженка | Молочнокислые стрептококки, единичные палочки |
| Ацидофильное молоко | Молочнокислая палочка |
| Кефир, кумыс | Молочнокислые стрептококки, палочки, единичные клетки дрожжей |
| Творог, сметана | Молочнокислые стрептококки |