Тема 10.3. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Иммунный статус человека складывается из комплекса не­специфических и специфических механизмов, обеспечиваю­щих антибактериальную, противовирусную и противоопухоле­вую защиту организма. К механизмам неспецифической защи­ты против бактерий относятся фагоцитоз гранулоцитами и моноцитами/макрофагами и активация системы комплемента по альтернативному пути. Макрофаги не только захватывают и убивают бактерии, но при контакте с ними продуцируют и секретируют биологически активные молекулы — цитокины, запускающие неспецифический защитный процесс воспале­ния. Механизмы неспецифической противовирусной и проти­воопухолевой защиты: клетки — естественные киллеры и мо­лекулы семейства интерферонов. Специфическую антибакте­риальную защиту против внеклеточно паразитирующих бакте­рий обеспечивают специфические антитела — иммуноглобули­ны путем усиления фагоцитоза (опсонизация) или активации системы комплемента по классическому пути иммунными комплексами. Специфическая защита от бактериальных токси­нов является функцией специфических антитоксических анти­тел — иммуноглобулинов, способных нейтрализовать экзоток­сины бактерий. Специфическую защиту против внутриклеточ-но паразитирующих микроорганизмов берут на себя активиро­ванные Т-лимфоциты и макрофаги, продуцирующие цитоки­ны: интерлейкины, гамма-интерферон, фактор некроза опухо­ли, обеспечивая при этом развитие в очаге инфекции реакции иммунного воспаления — гиперчувствительности замедленно­го типа (ГЗТ). Специфическую противовирусную защиту обес­печивают активированные цитотоксические лимфоциты (CTL), способные распознать инфицированную клетку и убить ее при непосредственном контакте. В специфической противовирус­ной защите велика роль специфических антител иммуноглобу­линов, которые могут нейтрализовать внеклеточные вирусы или вызвать гибель инфицированных вирусом клеток посред­ством антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ) естественных киллеров и других клеток.

Оценка иммунного статуса включает количественную и ка­чественную оценку основных факторов неспецифической за­щиты (фагоцитирующих клеток, системы комплемента, есте­ственных киллеров, системы интерферонов) и основных зве­ньев иммунной системы: Т-лимфоцитов и их главных конеч­ных продуктов — цитокинов; В-лимфоцитов и их главных ко­нечных продуктов — иммуноглобулинов.

Количественная оценка клеточных популяций начинается на этапе клинического анализа крови, который дает информа­цию о количестве циркулирующих в крови гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов. Дальнейшая дифференцировка лим­фоцитов основывается на наличии у них так называемых по­верхностных маркеров, т.е. особых молекул (их принято обо­значать "CD" — сокращение от английского термина "clusters of differentiation") в составе клеточных мембран, которые в качестве антигенов выявляются при взаимодействии со специ­фическими моноклональными антителами.

Качественная (функциональная) оценка клеточных популя­ций и субпопуляций проводится с помощью соответствующих функциональных тестов: у Т- и В-лимфоцитов оценивают про-лиферативный ответ на контакт со стандартными митогенами или микробными антигенами (реакция бласттрансформации лимфоцитов — РБТЛ) или ответ продукцией цитокинов на кон­такт с митогеном. У фагоцитирующих клеток оценивают функ­цию фагоцитоза: активность захвата стандартных частиц — объ­ектов фагоцитоза, бактерицидность фагоцитов косвенно оце­нивается по высоте окислительного взрыва, индуцированного фагоцитозом (НСТ-тест). Концентрацию молекул иммуногло­булинов четырех основных изотипов — классов (IgG, IgM, IgA, IgE) в сыворотке крови и в других биологических жидкостях (слюна, спинномозговая жидкость и др.) определяют, пользу­ясь наборами специфических моноклинальных антител, полу­ченных против изотипспецифических антигенов этих иммуно­глобулинов. С помощью наборов таких антител можно прово­дить реакцию комплексообразования (иммуноглобулины, при­сутствующие в сыворотке крови, выполняют в этой реакции функцию антигенов), результаты которой поддаются количест­венному учету с помощью нефелометра или спектрофотометра. Другой вариант учета — проведение твердофазного иммуно-ферментного анализа с участием тех же изотипспецифических моноклональных антител и антииммуноглобулиновой мечен­ной пероксидазой сыворотки против иммуноглобулинов мыши (так как все моноклональные антитела получены из клеток мышей).

План

Программа

Изучение методов оценки факторов неспецифической защиты организма.

Изучение методов оценки Т-системы иммунитета.

Изучение методов оценки В-системы иммунитета.

Демонстрация

Характерная морфология гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в мазке крови, окрашенном по методу Романовского-Гимзы.

Отдельные стадии фагоцитоза бактерий и дрожжеподобных грибов рода Candida макрофагами и гранул о-цитами.

Задание студентам

Произвести микроскопический учет фагоцитоза час­тиц латекса лейкоцитами крови. Рассчитать показате­ли активности фагоцитирующих клеток.

Протоколировать и оценить результаты определения гемолитической активности комплемента сыворотки крови.

По готовым результатам выявления поверхностных маркеров на мембранах мононуклеарных лейкоцитов крови рассчитать показатели относительного и абсо­лютного количества естественных киллеров, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, их субпопуляций в крови и сопоставить с интервалами колебаний этих показате­лей у здоровых лиц.

По готовым результатам иммуноферментного опреде­ления содержания в сыворотке крови иммуноглобули­нов разных изотипов (IgG, IgM, IgA, IgE) сделать за­ключение, сопоставив эти результаты с интервалами колебаний этих показателей у здоровых лиц.

Обосновать выбор специальных тестов для характеристики функций иммунокомпетентных клеток.

Методические указания

1. Методы оценки фагоцитирующих клеток крови. Образец крови или лейковзвеси инкубируют с бактериями или другими объектами фагоцитоза (частицы латекса, полистиреновые час­тицы) в течение 1—2 ч, после чего из этой смеси приготавли­вают мазок, окрашивают по методу Романовского—Гимзы и микроскопируют, подсчитывая 100 клеток для определения процента фагоцитирующих клеток и количества бактерий (час­тиц), захваченных этими клетками (рис. 10.3.1; на вклейке). В норме процент фагоцитирующих лейкоцитов колеблется от 40 до 80 %, а количество захваченных частиц на 1 клетку — от 1 до 5. В качестве косвенного показателя бактерицидности фагоци­тирующих клеток оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме клеток осадка темно-синего формазана. Чем ак­тивнее окислительный взрыв в фагоцитах, тем большая доля клеток содержит осадок формазана. После подсчета клеток доля формазан-положительных выражается в процентах. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц только с красителем без индуктора окислительного взрыва доля формазан-положитель­ных клеток не превышает 1—2 %. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц в присутствии индуктора окислительного взрыва (объекты фагоцитоза, бактериальный липополисахарид или полисахарид) все 100 % фагоцитов могут ответить окислительным взрывом и накоплением осадка формазана. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о де­фектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.

2. Методы определения количества лимфоцитов в крови. Изу­чение лимфоцитов начинается с их выделения из крови. Мо-нонуклеарные лейкоциты (лимфоциты, моноциты) отделяют от других клеток крови (гранулоцитов и эритроцитов) с помощью центрифугирования в градиенте плотности специальной смеси препаратов: фикол, верографин. Взятая из вены кровь смеши­вается с антикоагулянтом, вносится в пробирку с названной смесью и центрифугируется. Имеющие большую плотность эритроциты и гранулоциты образуют осадок на дне пробирки, а мононуклеарные клетки образуют кольцо на поверхности градиентной смеси, откуда могут быть перенесены в отдельную пробирку и отмыты от градиентной смеси.

Все зрелые лимфоциты имеют одинаковую морфологию: малых лимфоцитов с плотным ядром и узким ободком цито­плазмы. Дифференцировка популяций и субпопуляций лимфо­цитов связана с выявлением поверхностных маркеров — осо­бых для каждого типа клеток антигенов с помощью соответст­вующих специфических антител.

Естественные киллеры несут поверхностный маркер CD16. Все Т-лимфоциты (тотально) несут поверхностный маркер CD3. Т-лимфоциты делятся на субпопуляции: Т-хелперы несут маркер CD4, а цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) несут маркер CD8. Все В-лимфоциты несут поверхностный маркер CD19. В-лимфоциты несут на поверхностной мембране поверх­ностные иммуноглобулины, которые могут быть выявлены в качестве антигенов с помощью флюоресцирующих антиимму-ноглобулиновых антител (в том числе — против отдельных изо-типов иммуноглобулинов). Эти поверхностные иммуноглобу­лины также рассматриваются как поверхностные маркеры В-лимфоцитов.

Определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится с по­мощью двух разных вариантов методов:

люминесцентной или световой микроскопии мазков цельной крови или взвеси мононуклеаров, обработанных соответствующими моноклональными антителами, ме­ченными флюорохромом или ферментом;

автоматического подсчета клеток с использованием про­точного цитофлюориметра (рис. 10.3.2).

При использовании первого методического варианта важно получить видимый осадок комплексов антител с красителем на поверхности клетки. Этот метод очень трудоемкий и длительный. Подсчет количества основных субпопуляций лимфоцитов данным методом занимает неделю.

Клетки ниже порога флюоресценции

Клетки выше порога флюоресценции

Рис. 10.3.2. Подсчет лимфоцитов разных популяций и субпопуляций с помощью проточного цитофлюориметра.

В отличие от этого с помощью автоматизированного под­счета с использованием современного прибора — проточного цитофлюориметра — это удается сделать за один день. Образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель. Многие из них содержат только по одной клетке. Каждая капля проходит перед лазерным лучом. Если капля содержит клетку, клетка вызывает отклонение лазерного луча, а лазерный луч возбуждает свечение флюорохрома в молекуле антитела, связанного с антигеном на поверхности клетки (с поверхностным маркером). Чувствительный фотоумножитель

Популяции Поверх- % от всего Абсолютное количе-и субпопуляции костные количества ство клеток х 109 лимфоцитов маркеры лимфоцитов в 1 л крови Лимфоциты (всего) 100 1,50—3,50 В-лимфоциты CD19 15 (10-25) 0,30-0,90 Т-лимфоциты (всего) CD3 75 (60-90) 1,00—2,50 Т-лимфоциты/хелперы CD4 50 (32—65) 0,50—1,60 Т-лимфоциты/киллеры CD8 25 (16-39) 0,30—0,90 Естественные киллеры CD16 10 (5-15) 0,20—0,30

Изотип Обозна- % от всех Количество иммуногло- иммуноглобулина чение иммуно- булинов, г/л глобули- 1 нов сыво- средние интервалы ротки величины колебаний Иммуноглобулин G IgG 70—75 12,0 7,50—15,50 Иммуноглобулин М IgM 8—10 1,2 0,65—1,65 Иммуноглобулин A IgA 15—20 2,0 1,25—2,50 Иммуноглобулин Е IgE 0,005 0,0005 0—0,0005