Тема 2.3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

И УЛЬТРАСТРУКТУРА АКТИНОМИЦЕТОВ И СПИРОХЕТ

Введение. Актиномицеты (Actinomyces) относятся к порядку Actinomycetales, включающему семейства Actinomycetaceae, Strep-tomycetaceae и Nocardiaceae. Актиномицеты имеют нитевид­ную форму. Они способны к ветвлению и могут образовывать структуры, напоминающие мицелий одноклеточных грибов (рис. 2.3.1). Встречаются также палочко- и кокковидные фор­мы. Нити имеют длину 100—600 мкм и толщину 0,2—1,2 мкм. Актиномицеты неподвижны, лишены выраженной капсулы, жгутиков и пилей. Как и другие бактерии, актиномицеты ок­рашиваются простыми методами или по методу Грама. Акти­номицеты относятся к фирмикутным бактериям и окрашива­ются грамположительно. В отличие от других бактерий они способны размножаться не только поперечным делением, но и спорами.

Спирохеты относятся к порядку Spirochaetales. Они представ­ляют собой извитые подвижные бактерии. Патогенные спиро­хеты входят в семейство Spirochaetaceae и принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema и Leptospira. Их основные морфоло­гические признаки представлены в табл. 2.3.1.

Клетка спирохеты имеет форму нити, закрученной в виде спирали. Клеточная стенка обладает строением, типичным для грациликутных бактерий. В периплазматическом пространстве располагаются сократительные фибриллы — эндофлагеллы, которые прикрепляются к полюсам клетки с обоих концов, оплетают тело бактерии по направлению к центру клетки, где они переплетаются между собой. Фибриллы обладают сокра-

Таблица 2. 3.1. Морфологические признаки спирохет Род Число и характер Характер движения Окраска по методу завитков Романовского— Гимзы Borrelia 3—10, крупные, Толчкообразное, Сине-фиолетовая неравномерные сгибательно-по-ступательное Treponema 8—12, мелкие, Плавное, сгиба- Бледно-розовая равномерные тельно-поступа-тельное Leptospira Многочисленные Очень активное, Розово-сиренева-первичные завит- вращательно-по- тая ки, вторичные ступательное завитки в виде буквы S

План

Программа

Определение формы актиномицетов в препарате, ок­рашенном по методу Грама.

Методы изучения морфологии спирохет с дифферен­циацией по морфологическим признакам.

Определение формы и подвижности спирохет в при­жизненных препаратах.

Исследование спирохет в окрашенных препаратах.

Изучение электронограмм спирохет и спирилл.

Демонстрация

Препарат из чистой культуры актиномицетов. Окраскапо методу Грама.

Подвижность лептоспир (темнопольная микроскопия).

Боррелии в препарате толстой капли крови (окраска по методу Романовского-Гимзы).

а Задание студентам

Изучить морфологию актиномицетов в препарате. За­рисовать.

Изучить морфологию лептоспир с помощью методатемнопольной микроскопии. Зарисовать.

Изучить морфологию боррелий в препарате толстой капли крови. Зарисовать.

Методические указания

Морфологию спирохет изучают в нативных препаратах и в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзы. Пре­параты исследуют с помощью темнопольной или фазово-кон-трастной микроскопии, наблюдая за активным и характерным движением спирохет и особенностями их формы.

Приготовление мазка из крови. На чистое обезжи­ренное стекло ближе к одному из его концов поместить каплю крови. Другое предметное стекло со шлифованым краем прижать под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвинуть его к другому концу нижнего стекла. При этом кровь распределится по предметному стеклу тонким слоем. Высушить препарат на воздухе, фиксировать в жидком фиксаторе (метило­вый спирт или смесь этилового спирта и эфира).

Окраска препарата по методу Романовского-Гимзы (смесь метиленового синего, эозина и азура). На мазок нанести рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10—20 мин. Затем препарат про­мыть водой и высушить на воздухе.

Боррелии — возбудители возвратного тифа (B.recurrentis) окра­шиваются в фиолетовый, эритроциты крови — в розово-корич­невый, ядра лейкоцитов — в фиолетовый цвет. Трепонемы ок­рашиваются в бледно-розовый, лептоспиры — в розово-сире­неватый цвет.

Признак Риккетсии Хламидии Микоплазмы Размеры, 0,5— 4 мкм, поли- 0,25— 1,0 мкм, 0,2— 0,3 мкм, круг-форма морфны: встреча- шаровидные, ово- лые, овальные ются кокковид- идные или палоч- или нитевидные ные, палочковид- ковидные клетки* клетки ные, реже ните­видные клетки Особен- КС по типу фа- КС по типу гра- Лишены КС. Име-ности циликутных. Не циликутных; ли- ют выраженный строения имеют макрокап- шены пептидо- S-слой. Не имеют сулы, жгутиков, гликана. Не име- макрокапсулы, Неподвижны. Не ют макрокапсу- жгутиков. Не об-образуют споры лы, жгутиков. Не- разуют споры, подвижны. Не об- Подвижны за счет разуют споры внешнего цито-скелета Окраска По методу Здро- По методу Рома- — довского невского— Гимзы (микроколонии внутри клеток) Методы Световая, фазово- Световая, фазово- Электронная мик-выявле- контрастная, лю- контрастная, лю- роскопия ния минесцентная, минесцентная электронная мик- (для выявления роскопия микроколонии внутри клеток); электронная мик­роскопия

План

Программа

1. Изучение морфологии риккетсий, хламидий и мико-плазм.

Демонстрация

Хламидий в инфицированных клетках эпителия урет­ры, мазках-отпечатках из органов и культурах клеток.

Электронограммы риккетсий, хламидий и микоплазм.

Задание студентам

Изучить морфологию риккетсий в препарате, окрашенном по Здродовскому.

Изучить морфологию хламидий.

3. Изучить морфологию микоплазм.

Методические указания

Окраска риккетсий по методу Здродовского

Окрасить мазок разведенным фуксином Циля (10—15 ка­пель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.

Промыть водой.

Обработать мазок 0,5 % раствором лимонной кислоты или 0,01 % раствором хлористоводородной кислоты.

Промыть водой.

Окрасить метиленовым синим в течение 1 мин.

Промыть водой и высушить препарат.

Риккетсий, окрашенные по методу Здродовского, имеют красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитиру­ют, — голубая, ядра — синие.

Глава 3

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Введение. Бактерии в ходе эволюции освоили различные экологические ниши и приспособились к соответствующим источникам неорганических и органических веществ, наличию кислорода, температуре и другим факторам окружающей сре­ды. Создание условий, подходящих для выращивания (культи­вирования) микробов, необходимо для изучения их свойств и диагностики вызываемых ими заболеваний. Культивирование бактерий лежит в основе бактериологических методов иссле­дования.

Питательные среды. Применяют для выращивания (культи­вирования) микроорганизмов в лабораторных или промышлен­ных условиях. Любая питательная среда должна отвечать сле­
дующим требованиям:

— содержать все необходимые для роста и размножения бактерий вещества в легкоусвояемой форме;

— иметь оптимальные для бактерий физико-химические свойства: рН, влажность, осмолярность и др.

Компоненты питательных сред. Для построения органичес­ких компонентов микробной клетки необходимы азот, углерод, водород и кислород. Снабжение водородом и кислородом осу­ществляется за счет воды. В качестве источника углерода гете­ротрофные микроорганизмы используют органические соеди­нения, в первую очередь сахара, многоатомные спирты и ор­ганические кислоты. Источником азота могут служить неор­ганические соединения (соли аммония), а также олигопептиды и аминокислоты — продукты гидролиза белков различного про­исхождения (животного — мясо, рыба, казеин; растительного — соевые бобы, горох; микробного — дрожжи и др.).

Поскольку в состав микробных клеток входят не только органические, но и минеральные соединения, питательные среды должны содержать неорганические вещества: соедине­ния хлора, фосфора, серы, натрия, калия, кальция, магния и некоторые другие. Минеральные соли необходимы также для создания оптимальных для роста и размножения физико-хи­мических условий (рН, ионная сила и т.д.).

Микробам для нормального развития необходимы микро­элементы, преимущественно металлы (железо, медь, марганец и др.), которые входят в состав простетических групп молекул различных ферментов.

Кроме основных компонентов питательной среды, для жиз­недеятельности ауксотрофных микроорганизмов, к числу ко­торых относятся многие патогенные бактерии, требуется при­сутствие факторов роста — органических соединений, входя­щих в состав микробной клетки, но не синтезируемых ею самостоятельно. В качестве факторов роста могут выступать определенные аминокислоты, азотистые основания, витамины и др. Большинство бактерий нуждается в таких факторах роста, как витамины группы В и никотиновая кислота. Для роста некоторых патогенных бактерий в питательные среды надо добавлять нативные белки (кровь, сыворотку).

Для жизнедеятельности микробной клетки, безусловно, не­обходима вода как основной растворитель и среда для проте­кания всех биохимических реакций.

В бактериологической практике используют среды, различ­ные по происхождению. Синтетическими питательными сре­дами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Пре­имуществом синтетических сред являются их строго постоян­ный состав и воспроизводимость. Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями перера-ботанные нативные компоненты неопределенного состава — гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д. Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные натив­ные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

Различные потребнрсти микробов отдельных видов обуслов­ливают большое разнообразие питательных сред.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Для придания плотной консистен­ции к жидкой среде добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей. Агар-агар плавится при 80—86 °С, затвердевает при темпера­туре около 40 "С и в застывшем состоянии придает среде плот­ность. В плотные среды добавляют 1,5—2 %, в полужидкие — 0,3—0,7 % агар-агара. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют нативные компоненты (свернувшаяся сыворотка крови, свернувшийся яичный белок), которые сами по себе являются плотными.

Преимуществом плотных питательных сред является воз­можность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газо- ._s нов), имеющих макроскопические размеры.

По целевому назначению питательные среды делят на основ­ные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращива­ния многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пи­тательный агар. Такие среды также служат основой для приго­товления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов опреде­ленного вида (или определенной группы) из материалов, со­держащих разнообразную постороннюю микрофлору. При со­здании элективных питательных сред исходят из биологичес­ких особенностей, которые отличают данные микробы от боль­шинства других. Например, избирательный рост стафилокок­ков наблюдается при повышенной концентрации хлорида на­трия, холерного вибриона — в щелочной среде и т.д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред осно­ван на различиях в биохимической активности бактерий раз­ных видов вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который явля­ется диагностическим признаком для данного вида, в) цвет­ной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференциально-диагностические среды широко использу­ют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бак­терий.

Культивирование бактерий применяют, в частности, для выделения и идентификации чистых культур (схема 3.1).

а Выделение чистой культуры бактерий

Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого ма­териала, содержащего, как правило, смесь различных микро­организмов, является одним из этапов любого бактериологи­ческого исследования, проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсеменен-ности окружающей среды и т.д.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному при­знаку на биологические варианты — биовары. Биовары, разли­чающиеся по биохимическим свойствам, называют хемовара-ми, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствитель­ности к фагу — фаговарами и т.д. Культуры микроорганизмов одного и того же вида или биовара, выделенные из различных источников либо в разное время из одного и того же источни­ка, называют штаммами, которые обычно обозначают номера­ми или какими-либо символами.

Колония представляет собой видимое изолированное сооб­щество микроорганизмов одного вида, образующееся в резуль­тате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).

а Методы выделения чистой культуры

Для выделения чистой культуры применяют методы, ос­нованные на:

механическом разобщении бактериальных клеток;

предварительной обработке исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказыва­ ющими избирательное антибактериальное действие;

избирательном подавлении размножения сопутствую­ щей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов;

способности некоторых бактерий быстро размножать­ ся в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы).

Задание студентам

Ознакомиться с питательными средами и основными ингредиентами для их изготовления.

Выполнить I этап выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала, содержащего смесь бакте­рий:

а) приготовить мазок из исследуемого материала и окрасить его по методу Грама, микроскопировать,
оценить морфологию присутствующих бактерий и их концентрацию;

б) засеять материал на чашку Петри с МП А, нанося материал петлей и последовательно распределяя его шпателем;

в) наметить ход дальнейшего исследования по выде­лению чистых культур аэробных бактерий.

ЗАНЯТИЕ 2

Программа

II этап выделения чистых культур аэробных бактерий.

Особенности культивирования анаэробов; характер роста анаэробов на специальных питательных средах.

Демонстрация

Различные типы колоний аэробных бактерий.

Рост чистых культур анаэробов на средах Кита-Тароцци, Вейнберга, Вильсона-Блера, молоке и тиогликолевом бульоне.

Техника отсева культуры из колоний на скошенный агар.

Задание студентам

1. Выполнить II этап выделения чистой культуры аэро­бов из материала, содержащего смесь бактерий:

а) учесть результаты посева исследуемого материала на чашке Петри с МПА, отметить наличие или отсутствие колоний, в случае неудачи проанализи­ровать ее причины;

б) определить, сколько типов колоний имеется на чашке, и зарисовать их;

в) описать по принятой схеме колонии всех типов;

г) приготовить мазки из колоний каждого типа и ок­расить их по методу Грама, микроскопировать и занести данные в протокол;

д) произвести отсев чистой культуры из колонии каж­дого типа на скошенный агар;

е) наметить план дальнейшей работы.

2. Составить план выделения чистой культуры анаэробов.

Методические указания

Основные среды. Пептоныыи бульон. Выпускается в сухом виде; состав (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05; натрия хлорид — 4,95.

Питательный агар. Состав (г/л): ферментативный гид­ролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар — 12,5; натрия хло­рид - 5,5; рН 7,3+0,1.

Основные сложные среды— кровяные, сывороточные и асцитические. Их готовят путем добавления к питательному агару 5—10 % дефибринированной крови или сыворотки кро­ви либо 25 % асцитической жидкости. Для приготовления жидкой среды такие же количества сыворотки или асцитичес­кой жидкости добавляют к питательному бульону.

Агар Мюллера-Хинтон (основная плотная питатель­ная среда для определения чувствительности бактерий к анти­биотикам методом дисков): на 1 л дистиллированной воды 300 г мясного настоя (из говядины), 17,5 г гидролизата казеина, 1,5 г крахмала, 17 г агар-агара.

Элективные питательные среды. Пептонная вода 1 %, рН 8,0. Избирательная для холерного вибриона, который раз­множается быстро, опережая рост других микроорганизмов. Щелочная реакция среды не препятствует росту возбудителя холеры Vibrio cholerae, но тормозит рост других микроорганиз­мов.

Щелочной агар (плотная среда): питательный агар, рН 7,8, аналогично предыдущей среде элективен для V.cholerae.

Среда Леффлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для возбудителя диф­терии Corynebacterium diphtheriae.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Содержит повы­шенные концентрации хлорида натрия (8—10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает элективность среды для данных микроорганизмов. Среда по­зволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие ле-цитиназу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком во­круг колоний лецитиназоположительных видов (фермент рас­щепляет лецитин куриного желтка, который вносится в рас­плавленный и остуженный до 45 °С питательный солевой агар).

Среды для культивирования анаэробов. Среда Вильсо­на— Блера (железосульфитный агар). Готовится из питательного агара, к которому добавляют глюкозу, Na₂SO₃, FeCl₂. Анаэробные клостридии (C.perfringens) на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления Na₂SO₃ в Na₂S, который, соединяясь с хлоридом железа, дает осадок сульфида железа (FeS) черного цвета.

Среда Китта—Тароцци. Состоит из питательного буль­она, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают в тече­ние 10—15 мин на кипящей водяной бане для удаления возду­ха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелино­вого масла.

Тиогликолевый бульон с гемином (жидкая электив­ная среда для культивирования неспорообразующих анаэро­бов — представителей родов Bacteroides, Prevotella, Porphyro-monas): на 1 л дистиллированной воды 17 г гидролизата казеи­на, 3 г соевого гидролизата, 6 г глюкозы, 2,5 г хлорида натрия, 0,5 г тиогликолата натрия, 0,25 г L-цистеина, 0,1 г сульфата натрия, 5 мг гемина.

Дифференциально-диагностические среды. Среды Гисса. К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика­тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении угле­водов. Среда при рН 7,2—7,4 бесцветна. При разложении уг­леводов она приобретает красный цвет.

Среда Ресселя. Применяется при изучении биохими­ческих свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл). Содер­жит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромти-моловый синий. Приготавливают в пробирках по 6—8 мл в виде столбика со скошенной поверхностью. Цвет незасеянной среды травянисто-зеленый. Посев делают штрихом по скошен­ной поверхности и уколом в глубину столбика. Микроорганиз­мы , ферментирующие глюкозу до кислоты, вызывают измене­ние окраски столбика среды из первоначальной травянисто-зе-г леной в желтую; скошенная поверхность при этом приобретает синий цвет. Лактозоположительные микроорганизмы (Е. со//) изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый, Микроорганизмы, образующие щелочь, изменяют цвет среды в синий. Газообразование отмечается в толще столбика среды.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который со­стоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы и индикатора — основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или бледно-ро­зовая. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блес-koivi; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные ко­лонии.

Среда Плоскирева (б актоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, брилли­антовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными со­лям: и и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селек­тивной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (ки­шечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некото­рых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, пара-тифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные — красные.

Висмут-сульфит агар. Выпускается в сухом виде; со­держит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неоргани­ческие соли, бриллиантовый зеленый, агар. Среда предназна­чена для выделения сальмонелл. Дифференцирующие свойства среды основаны на способности микроорганизмов продуциро­вать Н₂S, который вступает в реакцию с цитратом висмута и образует соединение черного цвета — сульфит висмута. Среда резко угнетает рост сопутствующей микрофлоры за счет инги-бирующего действия бриллиантового зеленого и сульфита на­трия.

Техника посевов и пересевов культур микроорганизмов. Уни­версальным инструментом для производства посевов является бактериологическая петля (металлическая многоразовая или пластмассовая одноразовая). Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериологическую иглу, а для по­севов на чашки Петри — металлические, стеклянные или плас­тиковые шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплав­ких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их по­мещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

Все манипуляции с микробами осуществляют с помощью стерильных инструментов вблизи пламени горелки. Металли­ческую бактериологическую петлю перед использованием, по­сле каждой манипуляции и по окончании работы стерилизуют путем прокаливания в пламени горелки.

Культивирование микробов осуществляют посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях температуры, влажности, газового состава атмосферы ^и т.д. С этой целью материал, содержащий микроорганизмы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие или на плотные среды. В последнем случае посев может быть произведен как на поверхность, так и в глубину агара уколом. Предварительно посуду (пробирку, чашки Петри и др.) надписывают, указывая Дату посева и характер посевного материала (номер исследова­ния или название культуры). В зависимости от техники посева и концентрации микробов в посевном материале бактерии на поверхности плотной питательной среды могут давать равно­мерный сплошной рост — бактериальный газон, "сливной рост" (возникает при помещении большого количества микро­организмов на ограниченный участок поверхности агара) или образовывать изолированные колонии.

Техника посева материала на плотную питательную среду. Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического ра­зобщения микробов при посеве. С этой целью материал, взя­тый петлей, наносят на поверхность агара параллельными штрихами, чем достигается последовательное уменьшение кон­центрации бактерий вплоть до единичных клеток. Для сниже­ния концентрации бактерий можно также зигзагообразными движениями густо нанести материал на небольшой участок агара в верхней части чашки Петри, после чего петлю стери­лизуют, а материал распределяют параллельными штрихами по остальной части среды.

Другой способ состоит в приготовлении суспензии с малой концентрацией бактерий. Одну каплю такой суспензии нано­сят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают стерильным шпателем в среду, равномер­но распределяя материал по всей ее поверхности.

Получение бактериального газона. Посевы "га­зоном" производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питатель­ного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, ос­тужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают мате­риал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Получение сливного роста. В пробирку со скошен­ным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным дви­жением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив.

Техника стерильной работы с пробиркой и бактериологи­ческой петлей описана в теме 2.1.

Выделение чистых культур бактерий (ЧК)

I этап — получение изолированных колоний бактерий из исследуемого материала. При выделе­нии ЧК бактерий из испытуемого материала первоначально необходимо оценить концентрацию бактерий в материале. На I этапе выделения ЧК также осуществляют первоначальную идентификацию бактерий по морфологии и тинкториальным свойствам. Для решения этих задач из исследуемого материала готовят фиксированный мазок, окрашивают по методу Грама (или другими методами в зависимости от цели исследования) и микроскопируют. Если количество бактерий в поле зрения велико, исследуемый материал разводят в пробирке со стериль­ным изотоническим раствором хлорида натрия. При малом количестве бактерий в препарате весь объем образца засевают на жидкие среды обогащения с целью увеличения концентра­ции бактерий. При необходимости выделения определенного вида бактерий посев осуществляют на элективные среды.

Для выделения ЧК бактерий из испытуемого материала необходимо сначала разобщить находящиеся в нем микробы разных видов. Обычно для этого посев материала производят на плотную питательную среду таким образом, чтобы получить изолированные колонии присутствующих в нем бактерий (см. выше). После посева чашку переворачивают дном кверху, под­писывают и помещают в термостат при 37 °С на 18—24 ч.

Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который заключается в перемешивании различных разведений исследу­емого материала с расплавленным и остуженным питательным агаром в колбе или пробирке. После этого агар разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате.

Разделение бактерий с использованием физических и химичес­ких факторов осуществляют следующим образом. Для выделе­ния спорообразующих бактерий уничтожают неспорообразую-щие, прогревая исследуемый материал при 80 °С в течение 20 мин или подвергают кратковременному кипячению. Споры бактерий при этом сохраняются и при посеве прогретого ма­териала на питательную среду прорастают. Если материал со­держал только один вид спорообразующих бактерий, таким образом можно получить ЧК. Если материал содержал споры разных бактерий, дальнейшее выделение осуществляют стан­дартными методами.

При выделении ЧК психрофильных бактерий используют инкубацию при низких температурах, задерживающих рост со­путствующей микрофлоры. Так, например, для выделения ЧК возбудителя чумы (Yersinia pestis) посевы инкубируют при тем­пературе около 5 "С.

В ряде случаев ЧК бактерий можно получить путем подав­ления размножения части микробов в исследуемом материале воздействием на них факторами, к которым выделяемый вид устойчив. С этой целью используют антимикробные препара­ты, химические вещества и бактериофаги. В питательную среду вносят соответствующее вещество или фаг в строго определен­ной концентрации, препятствующей размножению сопутству­ющих бактерий, но не оказывающей выраженного ингибиру-ющего действия на исследуемый микроорганизм.

Кроме упомянутых, в бактериологической практике иногда применяют и другие методы. Например, для выделения чистой культуры бактерий рода Proteus (Proteus vulgaris) используют его способность к "ползучему" росту (метод Шукевича). При этом бактерии, засеянные в основание скошенного агара, за время культивирования распространяются по всей поверхности агара.

II этап — накопление ЧК для ее дальнейшей идентификации. II этап начинают с оценки результатов первичного посева материала и изучения кулыпуральных при­знаков выросших бактерий — особенностей их роста на пита­тельных средах.

Морфология микробных колоний является наиболее ин­формативным культуральным признаком. Колонии различают­ся по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности (рис. 3.1.1). По величине колонии могут быть крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2—4 мм) и малые (1—2 мм), по форме — круглые, розеткооб-разные, листовидные и т.д. Цвет колонии зависит от выработки определенного пигмента — белого, желтого, красного и др. Ко­лонии непигментирующих бактерий бесцветны. По консистен­ции различаются сухие, влажные, сочные или слизистые коло­нии. Поверхность колонии бывает гладкой, морщинистой, ис­черченной, плоской, выпуклой, вдавленной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахромчатым. Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю струк­туру.

При получении микробного газона характер роста бактерий может быть сухим, влажным, "ползучим", складчатым, пиг­ментированным. В жидкой питательной среде одни бактерии дают диффузное помутнение, другие характеризуются придон­ным или пристеночным ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности среды, другие — осадок на дне пробир­ки, что преимущественно определяется потребностью в кисло­роде.

Для оценки результатов первичного посева исследуемого материала чашки с посевами просматривают и изучают мор­фологию выросших колоний. Для определения морфологии бактерий и их тинкториальных свойств из материала колоний разных типов готовят мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Необходимо помнить, что родственные бак­терии могут отличаться по морфологии колоний и наоборот. Материал из изолированной колонии каждого типа пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засевают штрихом на скошенную поверхность агара в пробирку. Для выделения и накопления чистой культуры выбирают колонии только тех бактерий, которые присутствовали в исследуемом материале. Появление колоний других бактерий может быть результатом контаминации (загрязнения) посева посторонними микробами

вследствие недостаточно строгого соблюдения стерильных ус­ловий работы.

Особенности культивирования анаэробных бактерий. Все ма­нипуляции со строгими анаэробами должны осуществляться в бескислородных условиях. Для этого используют герметичные настольные камеры с регулируемым газовым составом среды. Посевы производят на специальные обогатительные (электив­ные) среды для анаэробов (тиогликолевую, Китта—Тароцци). Посевы инкубируют в специальных СО₂-инкубаторах или в анаэростатах (металлических или пластмассовых контейнерах, герметично закрывающихся крышкой, снабженной патрубками для заполнения газовой смесью нужного состава), которые помещают в обычный термостат. Для инкубации небольших по объему посевов (1—2 чашки Петри) применяют пластиковые пакеты, содержащие химические генераторы газовой смеси, которые обеспечивают полное удаление кислорода из воздуш­ной среды в течение нескольких минут.