Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления

1. Примеры тотального препарата - участки сальника или мягкой мозговой оболочки, растянутые на предметном стекле. 2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 4-х перечисленных этапов опускаются два - уплотнение материала и приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя). 3. Остаются: фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду.

При правильном выполнении полученные препараты могут храниться неопределённо долгое время.

Особенности приготовления препарата

1. Взятие материала и фиксация	Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3), а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии: вначале глутаральдегидом (стабилизация белков), затем - четырёхокисью осмия (стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).
2. Уплотнение материала	1. Образцы, как обычно, обезвоживают, а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы . 2. а) Заливку производят в специальных формах, б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате, в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей.
3. Приготовление срезов	1. Срез делают с помощью ультратома; их толщина - 30-50 нм (ср. с микротомными срезами - 10.000 – 20.000 нм). 2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла).
4. Окрашивание срезов	1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана). б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны. 2.Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными.

Вопросы для контроля

1. Назовите методы исследований в цитологии и гистологии
2. Каковы отличия световой и электронной микроскопии.
3. Из каких этапов состоит приготовление постоянных препаратов
4. Какие бывают красители для клеток и тканей?
5. Назовите основные части светового микроскопа

Практическая часть занятия

1.Работа с микроскопом

При выполнении практической работы следует помнить следующие основные правила обращения со световым микроскопом:

1.Поставьте микроскоп у края стола так, чтобы окуляр находился ближе к левому глазу. Тетрадь и все предметы, необходимые для работы, расположите справа от микроскопа.

2. Освещение устанавливается только с объективом малого увеличения; следует обязательно проверить центровку положения объектива; конденсор должен быть поднят до упора; диафрагма открыта полностью

3. При помещении препарата на предметный столик покровное стекло должно быть сверху; препарат на предметном столике должен находится против отверстия

4. При фокусировке следует помнить, что расстояние между нижней линзой объектива и препаратом при малом увеличении (х8) - около 10 мм, при большом (х40) - менее 1 мм;

5. С помощью макровинта поднимите предметный столик, чтобы расстояние между препаратом и фронтальной линзой объектива было 3-4- мм. окуляры, плавно поднимите объектив до положения, при котором хорошо видно изображение объекта. Для большей четкости изображения слегка прикройте диафрагму и опустите конденсор.

6. При переводе с малого увеличения на большое следует:

-расположить исследуемый участок препарата в центре поля зрения,

-перевести револьвер с объективом 40 и отцентрировать его положение,

-наблюдая в окуляр, увидите расплывчатое изображение предмета. -дальнейшее изучение объекта производите, пользуясь микровинтом, вращая его на 0.5-1 оборот.

7. После окончания работы с большим увеличением поверните револьвер, установите малое увеличение и снимите препарат.

Общий вид биологического микроскопа МБИ-1: 1-окуляр, 2-поворотная бинокулярная насадка, 3-винт для поворота , 4- револьвер, 5- объективы, 6-подвижный предметный столик, 9-конденсор и ирисовая диафрагма, 7 – препаратодержатель, 8 - подвижные лапки, 10- маковинт (винт грубой наводки), 11 - микровинт, 12 – осветитель, 13 – рукоятки управления,14 - основание штатива, 15 – регулятор освещения, 16 – выключатель.

Литература

Основными учебниками и учебными пособиями для подготовки к практическим занятиям и самостоятельной работы являются:

1. Быков В.Л. Цитология и общая гистология.-СПб.:SOTIS,1998.

2. Гистология/Под ред.Ю.И.Афанасьева.-М.:Медицина,1999.

4. Гистология: Учебник. 2-е изд., перераб. и доп./Под ред. Э.Г.Улумбекова, Ю.А.Челышева.-ГЭОТАР-МЕД, 2001.- 672 с.

5. Лабораторные занятия по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии/ Под ред. Ю.И.Афанасьева, А.Н.Яцковского.-М.:Медицина,1999.

Электронные учебные пособия

рекомендуемые для самостоятельной работы:

1.Данилов Р.К., Клишов А.А., Боровая Т.Г., Ващенков В.В. Гистология в мультимедиа.-СПб.:ВмедА, 1998

2.Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н., Горячкина В.Л. Руководство-атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии.-М.: ММА им. И.М.Сеченова.

3.Павлов А.В, Гансбургский А.Н., Щербаков О.О. Знаете ли Вы гистологию? InterNet – программа для самостоятельной работы.-Ярославль, ЯГМА, 2000.

Лабораторная работа №2