Способы приготовления препаратов и методы их исследования

Цель занятия.

После самостоятельного изучения теоретического материала и работы на практическом занятии студент должен знать:

1. Методы исследования структуры и функции клеток

2. Устройство светового микроскопа

3. Правила работы с микроскопом

4.Способы приготовления препаратов для световой микроскопии

5. Принцип работы электронного микроскопа

Приборы и материалы. Демонстрационный микроскоп Nikon Eclipse 50i, микроскоп Биолан, постоянные препараты

План изучения темы

1. Микроскопия

1.1. Световая микроскопия

1.1.1. Устройство микроскопа

1.1.2. Приготовление цитогистологического препарата

1.1.2.1. Взятие и фиксация материала

1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала

1.1.2.3. Приготовление срезов

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую

среду

1.1.2.4.1. Типы красителей

1.2.Электронная микроскопия

1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа

1.2.1.1. Особенности: электронная волна, электромагнитные "линзы"

1.2.1.2. Ход лучей

1.2.2. Особенности приготовления препарата

Краткая теоретическая часть занятия

Приготовление гистологического препарата

1. По способу изготовления и характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов: а) срезы фиксированных тканей (толщиной 5-15 нм), б) препараты свежезамороженных срезов в) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки), г) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты Чаще всего используются срезы. 2. По длительности хранения: временные препараты, постоянные препараты. 3. Приготовление препарата обычно включает следующие этапы: а) взятие и фиксация материала, б) обезвоживание и уплотнение материала, в) приготовление срезов, г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.

Взятие и фиксация материала

1. Взятие материала от исследуемого объекта. Образец получают несколькими путями: - у живого объекта в результате оперативного иссечения кусочков тканей (биопсия), - от животных, умерщвленных специально для этих целей, - от трупов. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1,0 x 1,0 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на сутки 2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза тканей. 3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.

Обезвоживание и уплотнение материала

1. Затем образцы уплотняют – для последующей их резке на микротоме. Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин. 2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов - 70%, 80%, 96%, 100% этанол - по 24 часа в каждом спирте. б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают затем в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. 3. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 о С. Дают парафину, остывая, затвердеть; - вырезают из него блок с заключённым образцом и - закрепляют на деревянном кубике.

Приготовление срезов

1. Кубики (В) вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов. 2. С помощью микрометрической механической системы (W) объекто-держатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (10 мкм). б) Микротомный нож (К), направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (S) (срез) заданной толщины. 3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло.

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин) 2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя при необходимости) и вновь промывают водой. 3. Препарат снова обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски.

Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.

Тип красителя	Пример	Окрашиваемые структуры
Кислые красители	Кислоты и кислые соли: эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря); кислый фуксин.	а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители	Основные соли: гематоксилин (точнее, продукт его окисления - гематеин); азур 2, кармин.	а) Красящиеся структуры - базофильные (сродство к основным красителям). б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами – ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.
Нейтральные красители	Смесь двух красителей: основного (азур 2) и кислого (эозин).	а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином (специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах). б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
Индифферент- ные красители	Судан III, Судан IV	Суданом окрашиваются жировые капли
4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.