Работа №10. Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации

Низкомолекулярные вещества из белкового раствора можно удалить достаточно быстро и полно с помощью гель-фильтрации. Принцип, лежащий в основе этого ме­тода, весьма прост. Хроматографическую колонку запол­няют гелем, набухшим в воде или буферном растворе.

Разделение веществ основано на различии размеров молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гра­нул геля и выходят из колонки в первую очередь, а не­большие молекулы через поры попадают в гранулы, вследствие чего задерживаются на колонке и движутся с меньшей скоростью (рис. 2, а). Метод гель-фильтрации

Рис. 2. Разделение веществ методом гель-фильтрации (схема).

часто называют разделением веществ по принципу молеку­лярного сита. Три стадии такого разделения показаны на рис. 2 (б, в, г).

Свойствами молекулярного сита обладают многие по­ристые материалы. Наиболее часто для этой цели приме­няют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой: например, гели полисахарида декстрана (коммерческое название «сефадексы»). При изготовлении сефадексов полисахаридные цепи декстрана соединяются поперечными сшивками. Существует несколько типов се­фадексов, различающихся как размером и количеством пор, так и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с молекулами разного разме­ра. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель. Чем выше скорость набухания геля, тем больше номер сефадекса. Для освобождения белковых растворов от со­лей обычно используют сефадекс марки G-25.

Материал для исследования. Яичный альбумин, 1 % раствор.

Реактивы.Биуретовый реактив; хромат калия К₂СЮ₄, сухой порошок; гель сефадекса G-25; дистиллированная вода.

Оборудование.Колонка с краном размером 1 х 25 см; делительные воронки или склянки с тубусом; воронки, химические стаканы; стеклянные палочки; штативы с пробирками; пипетки на 1 мл; стеклянная вата.

1. Приготовление геля: 4 г порошка сефадекса G-25 суспендируют в 200 мл дистиллированной воды в хими­ческом стакане. После отстаивания основной массы по­рошка воду с мелкими частицами осторожно сливают. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. При комнатной темпера­туре весь процесс полного набухания геля занимает 3 ч. Если нагреть суспензию на водяной бане до температуры 100 °С, то это время сокращается до 1 ч.

2. Подготовка колонки: в колонку с закрытым краном наливают небольшое количество дистиллированной воды. На дно колонки помещают кусочек стеклянной ваты, при этом необходимо удалить пузырьки воздуха. Затем в ко­лонку через воронку вливают густую суспензию геля се­фадекса.

Ход работы. 1. Нанесение раствора белка. Колонка при­готовлена заранее. Перед нанесением раствора открывают кран на колонке и наблюдают за уменьшением столбика воды над слоем сефадекса. Как только над поверхностью геля остается слой жидкости толщиной 1—2 мм, кран за­крывают и при помощи пипетки аккуратно наносят на гель 1 мл белкового раствора, в который предварительно добавляют 5 мг К₂Сг0₄. Кран открывают и следят за про­никновением раствора в гель. Снова закрывают кран, стенки колонки ополаскивают 1 мл дистиллированной во­ды при помощи пипетки, открывают кран и позволяют жидкости впитаться в гель. Затем кран закрывают и, стара­ясь не взмучивать гель, добавляют из пипетки аккуратно по стенке 4—6 мл дистиллированной воды.

2. Сбор фракций. В 14 пробирок отмеривают по 1 мл биуретового реактива. К колонке присоединяют дели­тельную воронку с водой и открывают кран. Собирают фракции с колонки по 20 капель (1 мл) в пробирки, со­держащие биуретовый реактив. Наблюдают изменение окраски на фиолетовую в порциях элюата, содержащего белок.

Выход хромата калия отмечают по появлению желтого окрашивания раствора в очередной пробирке.

Гель в колонке отмывают водой до полного удаления К₂Сг0₄. После этого колонка снова готова к употреб­лению.

Оформление работы.Описывают принцип метода; ре­зультаты опыта заносят в таблицу.

Форма записи

№ пробирки Фракция

Белок К2СЮ4

Отсутствие окраски обозначают знаком минус (—), по­явление окраски — знаком плюс (+), а несколько знаков плюс указывает на значительную интенсивность окраски. Выводы, полученные при анализе результатов опыта, так­же заносят в протокол.